寡核苷酸介导的诱变实验

1.  将一个单链噬菌体产生的噬斑转移至含有1 ml 灭菌TY培养基的1.5 ml 微量离心管中,60℃温育5min,以杀灭细菌细胞,剧烈振荡以释放琼脂中的噬菌体,离心2 min。

2.  将100 μl 上清转移至1 L 的烧瓶,瓶中装有100 ml 培养基,其中含0.25 μg/ml 的尿苷。

3.  加5 ml 处于对数生长中期的大肠杆菌培养液,于37℃剧烈 振摇培养6~18 h。

4.  以5 000 g 离心30 min,保留上清。

5.  确定噬菌体在ung - 大肠杆菌对ung + 大肠杆菌中的相对滴度。

4.  毎4体枳的上清加1体积的5×PEG/NaCl溶液以沉淀噬菌体,混匀,0℃温育1 h。

6.  5 000 g 离心15 min,倒弃上清,在15 ml Corex管内用5 ml TE缓冲液溶解沉淀,在旋涡混合器上剧烈振荡。

7.  将噬菌体溶液置冰上1 h,如上步再次离心以去除细胞碎片,再用酚抽提和乙醇沉淀单链噬菌体DNA,通过测260 nm 吸光值确定DNA浓度。
8.  在1.5 ml 微量离心管内加入下列试剂:

(1)20 μl  10×T4多核苷酸激酶缓冲液

(2)2 μl  10 mmol/l ATP

(3)突变的寡核苷酸(长15~20个核苷酸〉

(4)加水至20 μl

(5)2 U  T4多核苷酸激酶

(6)37℃温育60 min,加3 μl 100 mmol/l EDTA并加热至70℃终止反应。
9.  加含尿嘧啶的单链环状DNA模扳(通常为1 μg DNA溶解在1 μl 体积)至磷酸化的寡核苷酸中,加1.25 μl 20×SSC,充分混匀,离心5 s。

10.  将离心管放入一个盛有70 ℃水的500 ml 烧杯中,自然冷却至室温后离心5 s,置于冰上。

11.  加入下列试剂以形成杂交混合液:

(1)20 μl  5×聚合酶混合物

(2)2.5 U或T4 DNA聚合酶

(3)2 U T4 DNA连接酶

(4)加水至100 μl

(5)充分混匀,然后置于0℃5 min,室温5 min,37℃2 h。

(6)最后加3 μl 500 mmol/l EDTA终止反应。
12.  取20 μl  在0.8%的琼脂糖上电泳。对照泳道应包括单链环状病毒DNA,双链闭环DNA和带切口的双链坏状DNA。

13.  根据电泳结 果估算DNA的量,用1~100 ng的双链DNA产物转化ung + 大肠杆菌。

14.  选择性地或随机挑取所得克隆(噬斑或菌落)用以分离纯的克隆原种。

15.  通过DNA序列测定对选出的克隆进行分析。

2014-12-12