一、实验讨论

肺癌是对人类威胁最大的疾病之一。肺癌动物模型的建立是研究癌变机制、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。利用肺癌细胞株种植于裸鼠及SCID小鼠进行异种肿瘤移植已经成为建立肺癌动物模型的主要方法。目前已建成的各种肺癌细胞株，近年我国已建成很多肿瘤细胞系，并获得越来越广泛的应用。但在使用这些细胞系时，应持特别审慎态度，主要是应考虑到这些细胞在长期传代中是否有发生遗传性改变的可能。众所周知，长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的，另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化，其结果可能导致细胞产生生物学性状上的变动。以近年建成的各种肺癌细胞系为例，都已传代少则几十，多则百代以上后，才确认建成了细胞系，这就很难保证细胞从初代到建成时的性状仍是一致的。本研究利用人肺癌组织块种植的模型成瘤后的癌组织细胞，不仅保留了原代癌细胞的异型性，还保留了细胞排列顺序的一致性。而细胞的结构和排列顺序是其生物学行为的基础，因此本研究的动物模型对于进一步的个体化治疗的研究更有效。

相对于其他疾病，肿瘤临床治疗的有效率目前仍然偏低。随着人类基因组学、药物基因组学及肿瘤分子生物学研究的不断深入，研究者对肿瘤多成因、异质性的特点有了更加全面的认识。个体化治疗已经成为肿瘤临床治疗的发展方向和最有效的手段。但是，如何识别具有相同肿瘤发生部位、相同病理类型及病期的不同患者之间存在的差异成为实施个体化治疗的主要障碍。

本研究所建立的肺癌动物模型，其肿瘤来源于不同患者手术切除的标本，不再是某一个固定的细胞系。通过裸鼠成瘤实验显示生长出来瘤块的病理改变与人原发肺癌病理具有相同的组织学特点和排列结构，明显优于细胞系种植后所生长的瘤块，能够更好地代表不同患者个体，具有个体化特征。建模成功的肺癌动物模型，尽管其肿瘤来源于不同患者，但均能稳定传代，为今后进行肺癌个体化治疗的系列研究奠定了基础。

本肺癌动物模型的第1代建模成功率较低，其原因可能有：肿瘤自身的特性、肿瘤类型、组织分化、标本处理方法等不同，裸鼠的营养状态、感染情况等不同也有可能影响接种结果。另外，裸鼠虽然无T淋巴细胞，但其体液免疫仍较健全，随着裸鼠成熟或既往有感染使其免疫功能成熟或激活，也会导致建模成功率较低。目前，本肺癌模型尚需进一步完善，建模成功率有待进一步提高，传代后的肺癌细胞尚需进行更多的生物学检测，包括核型分析、电镜观察细胞一般结构及细胞骨架微丝微管的排列状态等。从分子细胞学角度考虑尚应检测癌基因和抗癌基因等。通过这些检测更好地证明其能够代表不同患者个体，具有个体化特征。

一、实验材料准备

1.  SPF级BALB C裸鼠先在实验室饲养1~2 d（空气层流室饲养，室温26 ℃~28 ℃，相对湿度50%），以适应室内环境，肿瘤移植时小鼠为4~6周龄，体质量15~20 g。

2.  个体化移植肿瘤为手术切除的人非小细胞肺癌新鲜标本组织块。

二、个性化人肺癌肿瘤组织块种植方法

1.  从手术切除的人肺癌新鲜标本中切取直径约1 cm左右组织块，保存于加入青-链霉素双抗的RPMI-1640培养液中，在标本获取6 h之内进行种植。

2.  超净工作台内以RPMI-1640培养液反复冲洗肺癌组织块，用剪刀将组织块修剪成直径约2 mm的小块，用25号接种针将其种植于BALB C裸鼠背部皮下组织内，每例人肺癌新鲜标本均移植入5只裸鼠体内，整个肿瘤组织块的制备和种植在无菌条件下进行，成瘤者为第1代。

三、 移植后动物饲养和种植肿瘤观察

1.  动物种植肿瘤细胞后在无特定病原体（SPF）条件下饲养，被种植同一例肺癌患者标本组织块的5只裸鼠饲养于同一笼舍之内。

2.  每日观察接种部位肿瘤生长情况，待发现肿瘤生长后，每隔3 d测1次肿瘤直径，计算肿瘤体积V，V（mm ³ ）=（D×d2）/2，D为肿瘤表面最长径，d为肿瘤表面最短径。

四、 肿瘤组织的传代

1.  待裸鼠皮下种植的人肺癌组织肿瘤体积达到800 mm ³ 后，处死裸鼠剥取瘤块，按1.3所述肿瘤种植方法,每例标本再移植入5只裸鼠体内。此为第2代肿瘤组织块。

2.  重复上述步骤，获得第3代肺癌组织块。

五、肿瘤组织病理学观察

取原代人肺癌肿瘤及第1、2、3代移植瘤部分组织固定于10%福尔马林中，石蜡包埋、切片、HE 染色，光镜下观察。

六、 人肺癌细胞株种植方法

1.  人肺癌细胞株A549、H1795，用含10%小牛血清的DMEM培养液，在37 ℃、2.5% CO ₂ 及饱和湿度的恒温箱培养，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，台盼蓝拒染法计数活细胞数占95%以上。

2.  在裸鼠背部皮下各接种1×10 ⁶ 个（约1 mL）肿瘤细胞，3周后成瘤，生长至肿瘤体积达到500 mm ³ 后，处死小鼠，剥取瘤块，固定于10%福尔马林中，石蜡包埋、切片、HE 染色，光镜下观察。