用肿瘤特异性T细胞治疗人类恶性肿瘤的一个主要问题是如何获得具有肿瘤特异杀伤力并能在体外扩增足够数量的T淋巴细胞，目前大多数实验室制备TIL是采用机械分离、酶消化、不连续密度梯度离心三步法对实体肿瘤组织进行分离，此法可获得数量较多的TIL，但细胞的增殖速度及活性均较低。

本研究使用的是直接分离法，此法省去了酶消化一步，操作简单，节省了酶剂及时间，虽然分离的TIL数量较少，但增殖速度快及活性高，两法在培养后期所获细胞的抗肿瘤活性并无差异。因此，在肿瘤标本

较大、结缔组织较少时是一种较为理想的TIL制备方法。

新鲜分离的TIL对丝裂原无或仅有轻微的增殖反应，对自体、同种异体及其他肿瘤细胞系的杀伤作用极弱或缺如，体外培养加入IL-2可改变TIL的抑制状态。

本研究观察到，经过4~5 d 静止期后常规培养TIL才开始逐渐增殖即与TIL低活性状态逐渐改善有关。T细胞表达IL-2受体需要抗原的不断刺激才能维持，去除刺激后，其表达的IL-2受体逐渐减少，对IL-2的反应性和增殖能力也随之降低。

残存的肿瘤细胞在TIL培养中具有体外继续致敏及对T淋巴细胞刺激增殖作用，使TIL转化成特异性T杀伤细胞。IL-2培养TIL后期肿瘤细胞逐渐死亡及消失，使TIL增殖失去了其可能的刺激原，增殖力下降。因此，本研究中常规TIL培养组细胞增殖力弱，存活时间短与此有关。

冷冻不仅能杀灭肿瘤细胞，而且还可以使冷冻损伤的肿瘤组织成为抗原刺激物，激发抗肿瘤免疫，经冷冻灭活的肿瘤细胞所释放的抗原量比放射线、激光照射灭活癌细胞所释放的抗原量高。本实验观察到加入冷冻瘤苗后TIL经过3~4 d 静止期后开始增殖，所需时间比常规培养TIL短，并且能长期培养，大量扩增，存活时间显著长于常规培养TIL，与上述理论一致。

本研究中，大体病理可见两组TIL治疗后肿瘤生长缓慢，直径较生理盐水治疗组小，差异有显著性，说明TIL具有抗肿瘤作用，在一定程度上能延缓肿瘤生长。经冷冻瘤苗刺激TIL治疗后肿瘤有缩小消退现象，而常规培养TIL治疗组则无，提示前者的抗肿瘤作用强于后者，并且有质的差别。

镜下观察到：冷冻瘤苗刺激培养TIL治疗组肿瘤有完全坏死现象，有大量淋巴细胞浸润者均为肿瘤缩小或稳定荷瘤小鼠；而常规培养TIL治疗组则无肿瘤完全坏死现象，仅少到中量淋巴细胞浸润，说明前者抗肿瘤作用强于后者，且抗肿瘤作用与淋巴细胞浸润程度有关，淋巴细胞多者抗肿瘤作用强，也提示离开体外培养体系后TIL仍能在体内存活并发挥抗肿瘤作用。

相比之下，对照组肿瘤灶状坏死，无或仅少量淋巴细胞浸润，小血管充血出血，说明趋向恶化。另外，从肿瘤周边纤维母细胞增生情况也可说明经TIL治疗后肿瘤扩散受到限制。

生物治疗的特点之一是显效时间慢，通常需要经过较长时间的观察才能见到明显治疗效果，因此本实验中经冷冻瘤苗刺激TIL治疗后，小鼠肿瘤逐渐消退或保持稳定，大体观变化不显著，但镜下可见肿瘤全部坏死或仅残余极少数，坏死组织被机体吸收需要一个过程，如果进一步延长观察时间，则会有更多的肿瘤消退甚至完全消失而痊愈的现象出现。

本研究结果表明，冷冻瘤苗能保持培养的TIL的增殖能力，并提高TIL在小鼠体内的抗肿瘤作用，为临床上应用TIL治疗肿瘤提供了重要的实验依据。

1.  TIL的分离及培养

（1）取荷瘤小鼠20只，处死后无菌条件下切除皮下瘤块，置于RPMI 1640培养液中，剔除坏死的肿瘤组织及表面结缔组织，剪碎过细胞筛收集单细胞悬液。

（2）将等体积的比重1.088及1.075淋巴细胞分离液及细胞悬液先后分别置于离心管中进行不连续密度梯度离心，经1800 r/min 离心20 min 后，1.075界面上为富含肿瘤细胞悬液，1.088与1.075之间界面为富含TIL悬液。

（3）收集TIL，用含10%小牛血清，IL-2100 u/ml RPMI1640培养液稀释调整细胞浓度成5×10 ⁵ /ml进行培养，分两组。

（4）一组每5天加入冷冻瘤苗，浓度为效应细胞/肿瘤细胞（E/T）=50/1，另一组不加冷冻瘤苗进行常规培养。

（5）培养条件为37℃，5%CO ₂ ，每5天计数1次，维持细胞浓度5×10 ⁵ /ml。

2.  冷冻瘤苗的制备

（1）取肿瘤细胞悬液，用RPMI 1640培养液稀释成1×10 ⁵ /ml 装于冻存管中

（2）用液氮速冻慢融3个冻融周期，置于-20℃冰箱中贮存，备用。

3.  荷瘤小鼠模型的制备

（1）抽取腹水型Hepa种鼠腹水，用生理盐水稀释至肿瘤细胞1×10 ⁶ /ml，于小鼠右侧腋窝皮下接种0.2 ml。

（2）1周后肿瘤长至直径约0.5 cm 左右即制成小鼠荷瘤模型供检测TIL抗肿瘤作用。

（3）待肿瘤生长至直径1~2 cm 时供分离TIL使用。

4.  培养后TIL的抗肿瘤作用分3组，每组20只小鼠。对照组瘤体内注射生理盐水0.2 ml；实验1组，瘤体内注射常规培养TIL1×10 ⁶ 个；实验2组，瘤体内注射加入冷冻瘤苗培养TIL1×10 ⁶ 个。隔3天注射1次，共6次。

5.  病理检查处死小鼠，测量肿瘤大小，结果用垂直方向直径平均值表示。肿瘤组织送病理检查，常规HE染色。淋巴细胞浸润程度根据Anneroth等的标准分为4级。0级为无浸润；Ⅰ级为淋巴细胞浸润仅限于肿瘤灶周围，面积不超过肿瘤25%；Ⅱ级为淋巴细胞向瘤灶中央浸润，面积占肿瘤25%~50%；Ⅲ级为淋巴细胞浸润面积超过肿瘤50%。

6.  统计学方法采用t检验和X ² 检验。