1. 转染前一天接种呈指数生长的细胞,密度为5×10 5 /10 cm 平板。加10 ml 完全培养液,在开始转染时细胞数应<10 6 /平板,以留足够供细胞扩增至少2倍的表面积。
2. 用TE缓冲液稀释质粒DNA至1 μg/μl ,4 ℃保存。
3. 将最适量的质粒DNA与500 μl 0.25 mol/l CaCl
2
混合,加入500 μl 2×BBS中,混匀,室温下温育10~20 min。
4. 将磷酸钙-DNA溶液逐滴加入培养皿的细胞中,同时晃动培养皿,在35℃ 3%CO 2 培养箱中温育15~24min。
4. 将磷酸钙-DNA溶液逐滴加入培养皿的细胞中,同时晃动培养皿,在35℃ 3%CO 2 培养箱中温育15~24min。
5. 用5 ml PBS洗细胞两次,加入10 ml 完全培养液。对于稳定转化,在35~37℃ 5%CO
2
培养箱中培养过夜。对于短暂表达,培养细胞48~72 h。
6. 在开始选择稳定的转化细抱前按1:10至1:30分传细胞。于35~37℃培养箱中培养过夜。
7. 将培养液换成选择培养液,或在适当的选择条件下培养细胞进行选择稳定的转化子。