一、材料与方法:
1、植物材料:螺旋藻(Spirulina platensis)、水稻(Oryza sativa)和烟草(Nicotianatabacum).
2、试剂和溶液:
(1)20×SSC:3mol·L-1柠檬酸钠,pH8.0:
(2)溶菌酶、10μg·μl-1Rnase、10%SDS(均为Sigma产品);
(3)酚:氯仿:异戊醇=25:24:1
(4)TE:10mmol·L-1Tris-HCL、1mmol·L-1EDTA,pH7.6。
3、提取步骤:
收集对数生长期的螺旋藻细胞,悬浮于5倍体积(v/w)含2mg·mL-1溶菌酶的20×SSC中,室温保持10分钟,偶尔摇动混匀。水稻幼苗和烟草嫩叶在液氮中研磨成粉状后,立即用5倍体积的20×SSC悬浮,并轻轻拌匀。上述悬浮液在冰上先放置3分钟,然后加入10% SDS至终浓度为2%,混匀;继续放置10分钟后,在4℃用11000×g离心15分钟。上清液转移至新的离心管中,并用相同体积的TE稀释,再加入RNase至终浓度为10μg·ml-1,室温放置30分钟。11000×g离心15分钟,所得的DNA沉淀用70%的乙醇洗两次后,真空中抽干或自然干燥,最后溶于适量的TE中。
二、结果与讨论:
利用本方法,从烟草、水稻和螺旋藻中提取了DNA。因为整个过程的操作步骤较少,也较温和,减少了DNA被弄断的机会,所以所得的DNA分子量较大,大部分都比完整的λ噬菌体的DNA(48.5Kb)还大。另外,用此方法所提的DNA的OD260/OD280的比值1.8至1.9之间,并能被限制性内切酶酶切,显示有较好的纯度。
在使用本方法时,须注意下面的几个问题。当20×SSC的悬浮液中加入SDS至2%后,溶液中会出现白色絮状物质,表明蛋白质已经变性,这是本方法的主要特点之一。它通过变性后离心而不是常用的多次酚抽方法,将绝大部分的蛋白质除去。离心所得的上清液,需要用TE稀释,这是因为溶液中的盐浓度较高,如不稀释,RNase就无法起作用;而且在沉淀DNA时,如用乙醇会将溶液中的盐析出,如用异戊醇则形成两相的界面,将溶液中盐的浓度降低后,就解决了这些问题。但是,加大稀释TE的体积,对于DNA的产量并无非常明显的作用,用等体积的TE稀释即可。DNA抽提液经RNase酶解后,再用酚:氯仿:异戊醇抽提一次,用以除去剩余的蛋白质和酶。本方法适用于大量和微量的DNA制备。大量制备时,RNase酶解和酚:氯仿:异戊醇的抽提步骤可以在DNA浓缩一些后再使用,这样就较便于操作,并且节省RNase和酚。通常,用这种方法能从每克新鲜组织中提取到10至15μg的DNA。