一、仪器和试剂:
1、仪器:电泳仪(满足稳压500V)、离心机、垂直板电泳槽、钳子、5ml、10ml移液管、微量进样器、聚丙烯离心管。
2、试剂:尿素,乙醇,甘氨酸,甲基绿,三氯乙酸,冰乙酸,过氧化氢,硫酸亚铁,抗坏血酸,α-氯乙醇。
3、药剂配制:
(1)蛋白质提取液:
小麦:0.05克甲基绿溶于25毫升α-氯乙醇中,加蒸溜水至100毫升。低温保存。
大麦:0.05克甲基绿溶于20毫升α-氯乙醇中,加入118克尿素,再加入1毫升β-巯基乙醇,加蒸溜水至100毫升。低温保存。
(2)电泳缓冲液:0.4克甘氨酸加蒸溜水溶解,加4毫升冰乙酸,定容至1000毫升。低温保存。
(3)凝胶缓冲液:1.0克甘氨酸加蒸溜水溶解,加20毫升冰乙酸,定容至1000毫升。低温保存。
(4)0.6%过氧化氢:30%过氧化氢2毫升,加蒸溜水至100毫升。低温保存。
(5)染色液:0.25克考马斯亮蓝加25毫升无水乙醇溶解,加入50克三氯乙酸,加水至500毫升。
(6)凝胶液:丙烯酰胺20克,甲叉双丙烯酰胺0.8克,尿素12克,硫酸亚铁0.01克,抗坏血酸0.2克,用凝胶缓冲液溶解并定容至200毫升。低温保存。
二、实验步骤:
1、样品提取:
一般每个样品测定100粒种子,若更准确地估测品种纯度,则需更多的种子。如果分析结果要与某一纯度的标准值比较,可采用顺次测定法(sepuential testing)来确定,即50粒作为一组,必要时刻连续测定数组,以减少工作量。如果只鉴定真实性,可用50粒。
取小麦或大麦种子,用钳子逐粒夹碎(夹种子时最好垫上小片清洁的纸,以便于清理钳头和防止样品之间的污染),置1.5毫升离心管中,加入蛋白质提取液(小麦0.2毫升,大麦0.3毫升)充分摇动混合,在室温下提取24小时,然后在18000×g条件下离心15分钟。取其上清液用于电泳。
2、凝胶制备:
从冰箱中取出凝胶溶液和过氧化氢液,吸取10毫升凝胶溶液,加1滴0.6%过氧化氢,摇匀后迅速倒入封口处,稍加摇动,使整条缝口充满胶液,让其在5-10分钟聚合封好。
吸取45毫升凝胶溶液,加3滴0.6%过氧化氢,迅速摇匀,倒入凝胶板之间,马上插好样品梳,让其在5-10分钟内聚合。
3、进样:
小心抽出样品梳,将玻璃板加在电泳槽上,用滤纸或注射器吸取样品槽中多余的水分,然后用微量进样器吸取10-20μl样品加入样品槽中。
4、电泳:
在前后槽注入电极液,前槽接正极,后槽接负极。然后打开电源,逐渐将电压增到500V电泳时,要求在15-20℃温度下进行。电泳时间一般为60-80分钟,具体时间可按甲基绿迁移时间来推算,电泳时间为甲基绿移至前沿所需时间的2-2.5倍。
5、染色:
将胶板小心的取下,在染色液中染色1-2天。一般情况不需要脱色,但为使谱带清晰,可用清水冲洗。
三、鉴定:
谱带命名可采用相对迁移率法,或电泳程式法。根据醇溶蛋白谱带的组成和带型的一致性,并与标准样品电泳图谱比较,坚定种子真实性以及测定品种纯度。