一、材料和设备
蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦或棉花的叶片。
721型分光光度计、真空泵(或注射器)、保温箱、天平、真空干燥器、打孔器、三角瓶、移液管、烧杯
药品
0.1 M 磷酸缓冲液(pH7.5)
0.2 M KNO3溶液
磺胺(对氨基苯磺酸胺)试剂:1克磺胺溶于25毫升浓盐酸后再用蒸馏水稀释至100 ml 。
α-萘胺试剂:0.2克α萘胺溶于25 ml 浓盐酸中,再用蒸馏水稀释至100 ml 。
NaNO2标准溶液:1克NaNO2溶于1000 ml 蒸馏水中配成NaNO2母液。实验时按处理稀释成要求浓度。如1微克/ ml :取母液1ml ,用蒸馏水稀释成1000 ml 。
二、实验步骤
1.将新鲜取回的材料叶片用水清洗后用吸水纸吸干水份。用打孔器取下直径为1厘米的园片,再用蒸馏水洗2-3次,将蒸馏水吸干。在天平上称取等重的叶子园片两份:每份0.4克左右(或每份取50个园片)。将两份园片分别置于下列两种溶液中,容器使用50 ml 三角瓶。
(1)0.1 M 磷酸缓冲液5 ml +蒸馏水5 ml 。
(2)0.1 M 磷酸缓冲液5 ml +0.2 M KNO3溶液5 ml 。
将三角瓶置于真空干燥器中,接上真空泵抽气,使园片沉于瓶底(也可将园片置于注射器中抽气)。将三角瓶置于30℃温箱中(黑暗)保温30分钟,然后分别取两种溶液各1 ml ,准备测定NO2-含量。
(注意取叶前叶片要进行过一段时间的光合作用。若组织中碳水化合物含量降低使此酶的活性降低。当组织内含糖量低时,可在反应液中加入30μ M 3-磷酸甘油醛或1,6-二磷酸果糖,可显著增加NO2-的产生)。
2.绘制标准曲线:磺胺比色法可测出低于1微克/ ml 的NaNO2含量。在0-5微克/ ml 浓度范围内绘制标准曲线。显色反应的速度与重氮化作用的速度及偶联反应的速度相关,因此受温度、酸碱度等影响,也造成灵敏度的变化,若标准样品与测定样品在相同条件下测定,则显色速度也相同,可以作比较。
吸取不同浓度的NaNO2溶液各1 ml 于试管中,(设置NaNO2溶液处理可为5、4、3、2、1、0微克/ ml )加入磺胺试剂2 ml及α-萘胺试剂2 ml ,混合摇匀。在30℃温箱中保温30分钟后立即于比色计上比色,用50号滤光片或在520毫微米波长下读取光密度(或透光率)。以NaNO2浓度为横座标、光密度为纵坐标绘制光密度-浓度标曲线。
3.NO2-含量测定:将吸取的测定样品1 ml 置于一试管中,加入磺胺试剂及α-萘胺试剂各2 ml,混合摇匀,静止30分钟(于30℃温箱中)后立即比色测定:在520毫微米下读取光密度。对比标准曲线,查出NO2-的含量。然后计算酶活性:以每小时每克鲜重产生的NO2-的微摩尔(μM )值表示。