一、材料仪器设备及试剂
1 .材料:植物根系伤流液。
2. 仪 器设备:层析缸;层析滤纸;微量滴管或玻璃毛细管;电吹风或电炉;烘箱;小喷务器。
3. 试 剂:正丁醇;冰醋酸;95%乙醇。
标准氨基酸溶液:天门冬氨酸,赖氨酸,丙氨酸,亮氨酸,苯丙氨酸,缬氨酸,精氨酸,谷氨酸,甘氨酸,组氨酸,脯氨酸,色氨酸,丝氨酸,苏氨酸等氨基酸分为3~4组溶于10﹪异丙醇中,即为标准氨基酸溶液混合液,每种氨基酸浓度为2mg. ml-1。
0.1%水合茚三酮乙醇溶液:称取0.1g水合茚三酮,溶于100 ml 95%乙醇中。
苯酚和水混合溶剂: 苯酚 :水(比例为3 :1)。
二、实验步骤
1. 单向层析
(1)点样:取层析滤纸一条,长约25cm,宽约4~5cm(如样品数多则应加宽)。在滤纸一端离边1.5~2cm处用铅笔轻轻划一线,然后用微量滴管或毛细管吸取伤流液在铅笔线的适当位置上点一点,另用标准氨基酸混合液在附近加一点(约5μl)。点的大小以不超过0.3cm为宜,二个样品之间应相距1.5~2cm。然后用电吹风吹干或在电炉上一定距离处烘干滤纸,注意温度不能超过80℃。如伤流液中氨基酸浓度较低,可在原点上重点几次(注意每点样一次,吹干后再重复点样),样点吹干后备用。
(2)层析:取大小适当的层析缸一个,加入苯酚 :水的混合液(比例为3 :1)50ml作为层析溶剂,或用正丁醇,冰醋酸和水的混合液(比例为40:10:50),然后将点好样品的滤纸挂入缸盖下,下端暂时不与溶剂接触。密闭缸盖,使滤纸与溶剂蒸汽平衡1 h后,将滤纸下端浸入溶剂,(注意点样点不能浸入溶剂,以免浸脱样品)。这时溶剂沿纸上升,待溶剂前沿距滤纸顶端还有2cm时,把滤纸从层析缸中取出,用铅笔在溶剂前沿处作上记号,然后悬在室内风干或在60~80℃下烘干。
(3)显色:滤纸干后,用喷雾器均匀地喷上0.1%的水合茚三酮乙醇溶液,略湿即可,然后在60℃~80℃烘箱中加热约10min,进行显色,此时有氨基酸处即呈现紫色斑点。
(4)鉴定:计算各点色斑的Rf值,并与标准氨基酸的Rf值相对照,即可鉴定出伤流液中氨基酸的种类。同时,根据各色斑的大小与颜色深浅,可约略知道各种氨基酸含量的多少。
2. 双向层析
双向层析适用于成分较复杂或分离较难的样品分析,且每张滤纸只能分析一个样品。
(1)点样:取两张20cm×25cm左右层析滤纸,在左下角离二边均为1.5~2cm处,用铅笔作上记号,用微量滴管或毛细管点样,一张点标准氨基酸混合液(约5μl);另一张点伤流液,点样点大小以不超过0.3cm为宜。如伤流液中氨基酸浓度较低,可在原点上重复点几次(注意每次点样后须吹干)。样点吹干后,将滤纸卷成筒状,二边可用线缝合(中间留一空隙),如图所示。
(2)层析
第一次层析:取两个层析缸,加入苯酚 :水的混合液(比例为3 :1)约50ml作层析溶剂,然后将点好样品的滤纸挂入缸盖下,下端暂时不与溶剂接触。密闭缸盖,使滤纸与溶剂蒸汽平衡1 h后,将滤纸下端浸入溶剂,(注意点样点不能浸入溶剂,以免浸脱样品)。经一段时间层析后,即待溶剂前沿距滤纸顶端还有2cm时,把滤纸从层析缸中取出,用铅笔在溶剂前沿处作下记号,然后悬在室内风干或在60~80℃下烘干,至无明显的溶剂气味为止。
第二次层析:将第一次层析的两张滤纸的线折开,滤纸调转90?,使原来的左边成为下边,再卷成筒状缝合如前所述。将层析溶剂改用正丁醇,冰醋酸和水的混合液(比例为40:10:50),其余层析方法与第一次层析相同。
(3)显色:第二次层析完毕,用喷雾器在风干的滤纸上均匀喷上0.1%的水合茚三酮乙醇溶液(略湿即可)。在60℃~80℃烘箱中加热约10min,进行显色。
(4)鉴定:显色完毕,用铅笔将各色谱和中心点描绘出来,然后量出由原点至色谱中心点和溶剂前沿的距离,计算出各种标准氨基酸和样品中未知氨基酸的色谱Rf值进行比较和鉴定。双向层析,其Rf值由两个数值组成, 即要在第一向和第二向层析中各计算一次, 根据Rf值及各氨基酸的特有颜色,将两张滤纸上的色斑进行对比,即可知道样品所含游离氨基酸的种类及名称。