一、材料仪器设备及试剂
1. 材料:水稻或小麦的叶片、幼穗等。
2. 仪器设备:真空抽气泵;真空干燥器;小烧杯;玻璃瓶塞;其它用具同离体法。
3. 试剂及配制:
亚硝酸钠标准液()。
0.1mol·L-1KNO3()。
1%磺胺(配制方法同离体法);
0.02%萘基乙烯胺()。
30%三氯乙酸溶液配制:称取30g三氯乙酸,水溶后定容至100ml。
二、实验步骤
1. 标准曲线制作 ( )。
2. 酶促反应
(1)称取作物叶片1.0~2.0g四份,剪成1cm左右的小段,分放于四个小烧杯中,用直径略小于烧杯直径的玻璃瓶塞将材料全部压于杯底,其中一份作对照,另外三份作酶活性测定用。
(2) 先向对照杯中加入1ml 30%三氯乙酸,然后各杯中都加入9ml 0.1mol·L-1KNO3溶液,混匀后立即放入干燥器中,抽气1min再通入空气,再抽真空,反复几次,以排除组织间隙的气体,至叶片完全软化沉入杯底,以便底物溶液进入组织。最后通入氮气密封后,在25℃黑暗中反应半小时,再分别向测定杯(对照杯除外)加入1ml 30%三氯乙酸终止酶反应。
3. 测定
将各杯摇匀静置2分钟后,各取2ml反应液到试管中,加入1ml 1﹪磺胺和1ml0.02﹪萘基乙烯胺,摇匀显色15min后,再倒入离心管中,在4000 r / min下离心15min,取上清液在520nm波长处测定吸光度(A)值。并从标准曲线查出反应液中的亚硝态氮含量(μg)。
三、酶活性计算 ( )。
2. 取样宜在晴天进行,最好提前一天施用一定量的硝态氮肥,取样部位应一致。
3. 硝酸盐还原过程应在黑暗中进行,以防亚硝酸盐还原为氨。
4. 从显色到比色时间要一致,显色时间过长或过短对颜色都有影响。