Carnoy固定液:
固定液的重要特性是能迅速穿透细胞,将其固定并维持染色体结构的完整性,还要能够增强染色体的嗜碱性,达到优良染色效果。单纯的固定液一般难以达到这些要求,因此在实验中使用两种混合的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。Carnoy固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)每次使用前需临时配制,长时间放置影响固定效果,固定时间15min至24h,冰箱、室温均可。必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例,冰乙酸比例增加,利于细胞膨胀、染色体铺展,但易导致细胞破裂、染色体散失。
低渗液(hypotonic solution)
低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液,渗透压低于组织液,与外周血混在一起时,水分迅速进入细胞,使其膨胀,甚至破裂,获得分散良好的染色体分裂象。常见的低渗液:水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾(0.65mol/L)、氯化钾(0.075mol/L)等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展,同时可使黏附于染色体的核仁物质散开,以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液,其优点有:①染色体轮廓清楚,可染色性强,染色时间短。②用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37℃,25~30min,以预实验条件为准。
Giemsa染液
Giemsa原液配制:称Giemsa粉末0.5g,加几滴甘油研磨,再加入甘油(使加入的甘油总量为33ml)。56℃中保温90~120min。加入33ml甲醇,置棕色瓶中保存。使用时按要求用PBS稀释,一般稀释10倍。
1. 体外培养的细胞,在倒置镜下观察到有较多的分裂细胞(传代后24h,圆形发亮的细胞)时,加入秋水仙素溶液,终浓度为0.3μg/ml培养液;
2. 继续培养3h;
3. 胰酶消化收集细胞至离心管;
4. 离心1000转/min,离心10min,去上清;
5. Hanks液洗,离心,去上清;
6. 低渗处理:加入0.075mol/L KCl溶液8ml,置37℃恒温水浴中30min,用吸管稍吹打(同上);
7. 固定及制片如外周血染色体的制备。
注意事项
1. 秋水仙素处理时间过长,分裂细胞多,染色体短小;反之,则少而细长,故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。
2. 固定液应在使用前临时配制。
3. 载玻片一定要洁净,否则染色体分散不好。
4. 染色体分裂指数低:患者处于非常时期(放、化疗期);培养基营养成分不良;培养基pH偏低或偏高;PHA过量或不足;小牛血清质量不高;培养箱温度偏低;秋水仙素处理时间过短。
5.接种的血样愈新鲜愈好。
6. 培养过程中,如发现血样凝集,可将培养瓶轻轻振荡,使凝块散开,继续放回37℃恒温箱内培养。