微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜(16mm,10×)、高倍物镜(4mm,40—45×)和油镜(1.8 mm,95—100×)三种。油镜通常标有黑圈或红圈,也有的以“OI(oil immer-sion)字样表示,它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜,可使被检物体放大1000—2 000多倍。从图Ⅲ-3中可看出油镜的焦距和工作距离(标本在焦点上看得最清晰时,物镜与样品之间的距离)最短,光圈则开得最大,因此,在使用油镜观察时,镜头离标本十分近,需特别小心。
使用时,油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气,而是隔一层油质,称为油浸系。这种油常选用香柏油,因香柏油的折射率n=1.52,与玻璃相同。当光线通过载玻片后,可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气,则称为干燥系,当光线通过玻片后,受到折射发生散射现象,进入物镜的光线显然减少,这样就减低了视野的照明度(图Ⅲ-4)。
利用油镜不但能增加照明度,更主要的是能增加数值孔径,因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径,即光线投射到物镜上的最大角度(称为镜口角)的一半正弦,乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积,可用下列公式表示:
NA=n•sinα
式中NA=数值孔径;
n=介质折射率;
α=最大入射角的半数,即镜口角的半数。
因此,光线投射到物镜的角度愈大,显微镜的效能就愈大(图Ⅲ-5),该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。
同时,α的理论限度为90°,sin90°=1,故以空气为介质时(n=1),数值孔径不能超过1,如以香柏油为介质时,则n增大,其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120°,其半数的正弦为sin60°=0.87,则:
以空气为介质时:
NA=1×0.87=0.87
以水为介质时:
NA=1.33×0.87=1.15
以香柏油为介质时:
NA=1.52×0.87=1.32
显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比,与光波长度成反比。因此,物镜的数值孔径愈大,光波波长越短,则显微镜的分辨力愈大,被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此,一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离,这两个因素是成反比关系的,通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米,这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。
式中λ=光波波长。
我们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55μm,假如数值孔径为0.65的高倍物镜,它能辨别两点之间的距离为0.42μm。而在0.42μm以下的两点之间的距离就分辨不出,即使用倍数更大的目镜,使显微镜的总放大率增加,也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜,增加其分辨力才行。例如用数值孔径为1.25的油镜时,能辨别两点之间的
因此,我们可以看出,假如采用放大率为40倍的高倍物镜(NA=0.65),和放大率为24倍的目镜,虽然总放大率为960倍,但其分辨的最小距离只有0.42μm。假如采用放大率为90倍的油镜(NA=1.25),和放大率为9倍的目镜,虽然总的放大率为810倍,但却能分辨出0.22μm间的距离。
一、实验报告1. 结果
分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的状态,包括在三种情况下视野中的变化,同时注明物镜放大倍数和总放大率。
2. 思考题
(1)在使用高倍镜和油镜进行调焦时,应将镜筒徐徐上升还是下降?为什么?
(2)用油镜观察时,为什么要在载玻片上滴加香柏油?
(3)在明视野显微镜下,观察细菌形态时,你认为用染色标本好,还是用未染色的活标本好,为什么?
(1)置显微镜于平稳的实验台上,镜座距实验台边沿约3—4cm。镜检者姿势要端正,一般用左眼观察,右眼便于绘图或记录,两眼必须同时睁开,以减少疲劳,亦可练习左右眼均能观察。
(2)调节光源,对光时应避免直射光源,因直射光源影响物像的清晰,损坏光源装置和镜头,并刺激眼睛。如阴暗天气,可用日光灯或显微镜灯照明。
调节光源时,先将光圈完全开放,升高聚光镜至与载物台同样高,否则使用油镜时光线较暗。然后转下低倍镜观察光源强弱,调节反光镜,光线较强的天然光源宜用平面镜;光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜。
在对光时,要使全视野内为均匀的明亮度。凡检查染色标本时,光线应强;检查未染色标本时,光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。
2. 低倍镜观察
检查的标本需先用低倍镜观察,因为低倍镜视野较大,易发现目标和确定检查的位置。
将金黄色葡萄球菌染色标本置镜台上,用标本夹夹住,移动推动器,使观察对象处在物镜正下方,转动粗调节器,使物镜降至距标本约0.5cm处,由目镜观察,此时可适当地缩小光圈,否则视野中只见光亮一片,难见到目的物,同时用粗调节器慢慢升起镜筒,直至物像出现后再用细调节器调节到物像清楚时为止,然后移动标本,认真观察标本各部位,找到合适的目的物,并将其移至视野中心,准备用高倍镜观察。
3. 高倍镜观察
将高倍镜转至正下方,在转换物镜时,需用眼睛在侧面观察,避免镜头与玻片相撞。然后由目镜观察,并仔细调节光圈,使光线的明亮度适宜,同时用粗调节器慢慢升起镜筒至物像出现后,再用细调节器调节至物像清晰为止,找到最适宜观察的部位后,将此部位移至视野中心,准备用油镜观察。
4. 油镜观察
(1)用粗调节器将镜筒提起约2cm,将油镜转至正下方。
(2)在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。
(3)从侧面注视,用粗调节器将镜筒小心地降下,使油镜浸在香柏油中,其镜头几乎与标本相接,应特别注意不能压在标本上,更不可用力过猛,否则不仅压碎玻片,也会损坏镜头。
(4)从接目镜内观察,进一步调节光线,使光线明亮,再用粗调节器将镜筒徐徐上升,直至视野出现物像为止,然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像,必须再从侧面观察,将油镜降下,重复操作至物像看清为止。
(5)用同样的方法观察枯草芽孢杆菌染色标本。
(6)观察完毕,上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油,然后用擦镜纸蘸少许二甲苯(香柏油溶于二甲苯)擦去镜头上残留油迹,最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头,以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。
(7)将各部分还原,反光镜垂直于镜座,将接物镜转成八字形,再向下旋。同时把聚光镜降下,以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。