1. 样品制备
颈椎脱臼处死小鼠,剖腹取小鼠肝组织,用生理盐水制成5g/L的匀浆。如有块状不溶物,会造成加样误差,应先以500 rpm离心5min,取上清液备用。
2. 标准曲线的绘制
(1)常量法:
在试管中分别加入BSA标准液: 12. 5, 25, 50, 75, 100, 125, 150 μl (即含BSA分别为6. 25, 12.5, 25, 37. 5, 50, 62. 5, 75μg) , 然后分别加生理盐水补充使其体积为200μl,空白管加200μL 生理盐水,混匀后各加考马斯亮蓝显色液4000μl,摇匀, 室温放置5 min 后, 在595 nm比色测光密度。
(2)微量法:
在96 孔板中分别加入BSA 标准液1. 25, 2. 50, 3. 75, 5. 00, 6. 25, 7. 50 μL (含BSA分别为0. 625, 1. 250, 1. 875, 2. 500, 3. 125, 3. 750 μg),再用生理盐水补充使每孔液体体积为10μl, 空白孔只加生理盐水10 μl, 慢慢摇匀后,分别各加CBB 显色液200μl摇匀, 室温放置5 m in 后, 在酶联免疫测定仪600nm 直接测定吸光度。将各自测定的结果在作直线回归,并作图。
3. 样品蛋白含量测定
测定方法同上,取合适体积的未知样品液,使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据分别所测定的A595nm,600 nm值,从回归方程计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
4. 从测定结果计算出样品的蛋白质浓度,并用统计学方法说明两种测定方法的相关性。
2. 如果测定要求很严格,可以在试剂加入后的5~20min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。
3. 测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,对测定结果会有一定的影响,所以常量法每测定完一样品后要用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
4. 如有全波长的酶联免疫检测仪,测定波长就选600nm。