在pH值为8.0~8.3时,核酸分子碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电,在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用下,使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异,从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料(如EB)后,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
1. 取10 μl DNA于0.8% 凝胶检测;
2. 将DNA调节浓度至300-400 ng/
μl ;3. 仔细阅读将所用的任何一种酶产品说明书,熟悉反应条件及酶切的贮存浓度(10U-50 U/ μl )厂家配套试剂;
4. 计算据反应条件所需要的各种试剂准确用量:(0.5 ml tube中)
DNA(3-5 mM) 10 μl
buffer reaction ´10 1.5 μl
Enzyme (15 U/ μl ) 0.8 μl (冰上)
ddH 2 O 2.7 μl
混匀,短暂离心;
5. 37 ℃ 温浴1-2 hrs (纯DNA) 或10 hrs(粗制DNA);
6. 加入上样缓冲液终止酶切反应,也可65 ℃加热10 min使酶变性失活;
7. 电泳检测酶切效率:
每个样品取1/10量用琼脂糖电泳检测,制胶及点样方法同上。