1. 用一种或多种限制性内切酶在100 μl 体积中消化10 μg 质粒人,产生25~100 bp 的含有结合位点的DNA片段,并至少有一端是5’突出的。
2. 加100 μCi[α- 32 P]dNTP,4μl 5 mmol/l 3种NTP的混合液,2.5U Klenow酶。室温温育20 min。
3. 加4 μl 含有5 mmol/l 与被标记的相同的dNTP溶液,室温温育5 min。
4. 沉淀DNA,溶解于TE中。
4. 沉淀DNA,溶解于TE中。
5. 加10×加样缓冲液,用2%小型琼脂凝胶(含溴化乙锭5 μg/ml)在TAE或TBE缓冲液中进行电泳。
6. 在长波透射紫外灯下观察电泳带。在带的下游切一平行缝隙,插入一片DEAE膜(先在凝胶缓冲液中浸湿)。将膜紧挤于胶中,继续电泳直到泳动至膜上。
7. 将膜在电泳缓冲液中洗一下,在滤纸上吸干。将膜放入1.5 ml 螺口盖的圆底管底部,其中装有400 μl DEAE洗脱液,68℃水浴30 min。
8. 将洗脱液移入1.5 ml 的离心管中,4℃微量离心15 min。将上清转入干净管中,留10 μl 于原管管底。
7. 将膜在电泳缓冲液中洗一下,在滤纸上吸干。将膜放入1.5 ml 螺口盖的圆底管底部,其中装有400 μl DEAE洗脱液,68℃水浴30 min。
8. 将洗脱液移入1.5 ml 的离心管中,4℃微量离心15 min。将上清转入干净管中,留10 μl 于原管管底。
9. 在上清中加入4 μl 1 mol/l MgCl
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。用1 ml 100%乙醇沉淀DNA,重悬于100 μl TE缓冲液中。
10. 取1 μl 测定cpm/μl min,用溴化乙锭打点法定量估计DNA浓度。
11. 安装16 cm 长的电泳玻璃板和1. 5 mm 厚的垫片。在40 ml 低离子強度凝胶混合液中加100 μl 30%的过硫酸铵及34 μl TDMED,灌入玻璃板之间,插入齿宽≥7 mm 的梳子。让胶聚合20 min。
12. 将梳子和底边的垫片取出。将胶放入盛有低离子强度电泳缓冲液的电泳漕中,用双头泵以5~30 ml/min 循环电泳缓冲液。100 V(约22mA)预电泳90 min以上,
12. 将梳子和底边的垫片取出。将胶放入盛有低离子强度电泳缓冲液的电泳漕中,用双头泵以5~30 ml/min 循环电泳缓冲液。100 V(约22mA)预电泳90 min以上,
13. 在微量离心管中,加终体积15 μl 的下列成分:10 000 c/min 的DNA探针,终浓度300 μg/ml BSA,及取自缓冲液中的粗制蛋白提取物中的大约15 μg 蛋白质。混匀,置30℃水浴15 min。
14. 在1个加样孔加入少量10×加样缓冲液并让染料跑进胶。在其他孔中加各结合反应液,在约30~35mA下电泳,直至溴酚蓝(相当于约70 bp 的条带)达到胶底。
15. 卸下凝胶电泳装置,撬开电泳玻璃板,将粘附了凝胶的玻璃板平放在实验台上,在胶上放置3张Whatman 3MM滤纸。将滤纸连同凝胶一起揭下。
16. 用塑料薄膜包裹凝胶进行真空干燥。在不使用增感屏的条件下,凝胶膜放射自显影过夜,或用增慼屏放射自显影2~3 h。
16. 用塑料薄膜包裹凝胶进行真空干燥。在不使用增感屏的条件下,凝胶膜放射自显影过夜,或用增慼屏放射自显影2~3 h。