一、实验试剂:
1. 凝胶储备液制备及工作混合液比例表
2. 脱色剂:乙醇1000ml,冰醋酸320ml加水至4000ml.
3. 染色剂:考马斯蓝0.46g,溶于400ml脱色剂中。
4. 溴酚蓝水溶液:溴酚蓝0.05g,水溶至100ml。
二、实验操作
1. 按上表所给的比例配制分离胶,3号试剂要最后加,之后快速混匀.立刻往已封底中的玻璃管中加入上述分离胶约至管长的2/3处,然后沿管壁轻轻加入一薄层水封闭空气.一般在20℃室温中约40分钟左右便形成凝胶.倾去水层,倒立在滤纸上将管内水分沥干,接着按上表已制浓缩胶,6号试剂最后加入,快速混匀,立刻加在分离胶之上距管口上缘8mm处,其上再轻轻加一薄层水,令其在日光灯照射下聚合,约20分钟左右即可聚合完毕,倾去水层.
2. 将管底口封闭打开,将装柱完毕的玻璃管插入电泳槽孔中(分离胶在下面),周围不得漏水.
3. 加样:先将4号液稀释(取2ml4号液,加水至6m1).取血清0.5m1,加4号液释液1.5ml,加7号3滴及溴酚蓝试剂3滴,混匀.检查凝胶管上下口是否已浸在缓冲液中,否则要进行调整.用微量加液器吸取上面已经准备好的样品30-35ul(约含血清7.5ul),沿管壁慢慢将加样器针头伸到上端胶面处.将样品缓缓加到胶面上(要成层不要分散开来)。
4. 电泳:上槽接负极,下槽接正极,盖上电泳槽盖,开启电泳仪开关调节输出电压。使每管电流量为1-2mA,待溴酚蓝批示剂进入分离胶后,加大输出电压,使每管电流增至4-5mA,当溴酚蓝指示剂泳动到距管下次端0.5cm时停止电泳.
5. 剥胶:比电泳槽上取下胶管,用长针头注射器吸满水后,将针头紧贴管壁慢慢插入,且边插边旋转玻璃管,边将水注入,使凝胶与内管壁分离开,令其脱出,放入染色液中。
6. 固定与染色:让剥出的胶柱在染色液中染色30分钟,凝胶被国定,蛋白质染上蓝色,成若干个圆盘样区带。脱去浮色:将染色后的胶柱轻轻转入小试管中,加入脱色剂浸泡,并多换洗几次,直至背景清晰及区带清晰为止.