一、 实验器材:
l. 电压用稳压整流器,有流水冷却装置的电泳槽(国产电泳仪一般都可使
用)
2. 水平台。
3. 10cmX7cm玻璃板及同样大小的聚脂薄膜(选择不被染色的投影仪用薄
膜即可).
4. 搭桥用纱布及滤条。
5. 粗滤纸若干张。
6. 琼脂糖胶打孔器。
二、实验试剂:
1. 巴比妥缓冲液,离于强度0.05 PH8.6
2. 10g/l琼脂糖(标准电内溶)用巴比妥缓冲液配制,加热溶化,沉淀后,分装10ml/管,冷却后4℃贮存。
3. 0.15mmol/lNaCl溶液。
4. 免(或羊)抗人apoA抗血清(效价不低于1:16)及apob抗血清(效价
不低于1:32)。
5. 定值参考血清.
6. 染色染:考马斯亮蓝R-250,0.259g溶于甲醇45ml中,加冰醋酸10ml及45ml混合,溶后备用。
7. 脱色液:每升含冰醋酸50ml及甘油100ml。
四. 实验操作:
l. 浇板:每板用1g/dl琼脂糖10ml,沸水浴中融化,混匀,冷至50-55℃
时加人apoA抗血清50ul,的apoB抗血清8ul(用量视抗血清效价而定),迅速混
匀后再预置在水平台上的玻璃板上冷却后放在4℃,20min后打孔,孔在板的阴
极端,孔径3mm,孔间距至少5mm,孔容量5ul,把板放在电泳槽,用滤纸搭桥。
2. 稀释抗原:用0.15mmol/lNacl液将定值参考血清稀释成1:100. 1:150. 1:200. 1:300及1:400(作标准曲线之用),血清标本按1:20O稀释,放4℃冰箱不超过3天。
3. 加样:在低电流状态(10mA/板)将稀释好的定值血清及样本分别吸取5ul(准确),加人琼脂糖凝胶加样孔内,每板都要做一系列标准。
4. 通电:稳电稳流24mA/板,端电压6-8V/cm,以流水冷却使琼脂保温15C电泳3-4h。
5.脱杂蛋白及了胶膜:电泳后的琼脂糖板浸泡在0.15mmol/lNaCL中3Omin,将胶膜抗置于聚脂膜上,用多层滤纸在轻轻加压吸干腔内水分,完后将滤纸. 胶膜与聚脂膜在者仪器自然干燥,或用热吹风机吹干,干后胶膜会自然与滤纸及聚脂膜分开。
6. 涂色:将琼脂糖胶膜平铺浸泡于染色液内20-30min。
7.脱色:用脱色液浸泡以染色的胶膜至火箭样清晰,背景基本无色,可在水
中用两张玻璃在将胶膜夹住,晾干后可长期保存,也可以用流水浸泡脱色至背景
干净。
三、计算:测量5种浓度的血清与每个标本的锋高(从孔中心到锋尖计),apoA1峰高于apoB峰,两者分别接抗原浓度与锋高作标准(或直线,但在轴上有截距)在曲线上查出每个标本中的apoA1与apoB浓度。
本法测定范围是:apoA1 0.4-2.5g/l apoB 0.3-2.0g/l
2. 不同种类来源的血清(如兔与羊)在等效价的情况下进行试验,结果会有差异,apoA1测定以兔抗血清为好,用兔血清时锋逐形尖细,而羊血清所产生的峰粗l,锋尖圆钝,优势在峰项出现虚影。
3. 在一定条件下电泳不同的稀释度,参考血清的锋高不会有明显变动,标准曲线斜率基本一致,如标本峰高超出标本曲线范围时,应调整标本稀释倍数后测板间CV通常小于5%。
4. 火箭电泳结果可用染色法或直接肉眼观察可见的火箭峰.前者用样本mmol/少抗血清,但如适当增加标本及抗血清用量.不着色更为方便。
5“火箭峰的测量可以计算面积或峰高,面积是峰高乘以峰宽(峰半高处的宽度)测量精度最好能达0.1mm, 需用机械或电子放大设备。