Trizol试剂是一个包含酚、异硫氰酸胍和SDS的单相酸性溶液,其在裂解细胞的同时抑制RNase的活性,随后加入氯仿,酚会大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同,造成DNA分布在下层的氯仿酚溶液中,RNA则分布在上层的水相中,最后用异丙醇沉淀水相中的RNA,并用70%乙醇洗涤沉淀,这样就可以得到比较纯净的总RNA。
一、 先在研钵中加入液氮,再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末,用液氮预冷的药匙取50-100 mg组织粉末加入已盛有1 ml的Trizol液的EP管中(注意组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%),充分混合均匀。
二、 室温放置5 min,然后加入200 μl的氯仿,盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。
三、12 000 rpm离心10 min,取上层水相于一新的EP管中(千万不要将中间的沉淀层和下层液混入,否则重新离心分离),加入500 μl异丙醇,温和颠倒混匀。室温放置10 min,12 000 rpm离心10 min。
四、 小心地弃去上清液,加入1 ml的75%乙醇,涡旋混匀,4℃下12 000 rpm离心5 min。重复操作一次。
五、 弃去上清液(尽量将残余液体除去),室温或真空干燥5-10 min(注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度)。用30 μlDEPC处理过的水将RNA溶解,必要时可55℃-60℃水浴 10 min。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。