RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶,不同的RNA条带也能分开,但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下,RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时,一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时,配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。
一、实验材料、器具及药品
蘑菇的总RNA溶液。 电泳仪,电泳槽,电子天平,移液器,枪头,微波炉,紫外透射检测仪等。 琼脂糖,1XTAE电泳缓冲液,0.5 μg/ml溴化乙锭(EB)10X载样缓冲液。
二、实验步骤
1. 用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶,加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。
2. 在超净工作台上,用移液器吸取总RNA样品4 μl于封口膜上。在实验台上再加入5 μl 1×TAE电泳缓冲液及1 μl 的10X载样缓冲液,混匀后,小心加入点样孔。
3. 打开电源开关,调节电压至100 V,使RNA由负极向正极电泳,约30min后将凝胶放入EB染液中染色5 min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。
三、 RNA的变性琼脂糖凝胶检测
1. 试剂
(1)MOPS缓冲液(10*):0.4 mol/L 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) (pH7.0),0.1 mol/L NaAc,10 mol/L EDTA。
(2)上样染料:50%甘油,1 mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝,0.4%二甲苯蓝。
(3)甲醛。
(4)去离子甲酰胺。v电泳槽清洗:去污剂洗干净(一般浸泡过夜)——水冲洗——乙醇干燥——3%H
2
O
2
灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。
2. 操作
(1) 将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍,晾干备用。
(2) 配制琼脂糖凝胶。
①称取0.5 g琼脂糖,置干净的100 ml 锥形瓶中,加入40 ml蒸馏水,微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。
②待胶凉至60--70 ℃,依次向其中加入9 ml 甲醛、5 ml 10X MOPS缓冲液和0.5 ul 溴化乙锭,混合均匀。
③灌制琼脂糖凝胶。
(3) 样品准备:
① 取 DEPC处理过的500 ul小离心管,依次加入如下试剂: 10x MOPS缓冲液2 ul,甲醛3.5 ul,甲酰胺(去离子)10 ul,RNA 样品 4.5 ul,混匀。
② 将离心管置于60℃水浴中保10分钟,再置冰上2分钟。
③ 向管中加入3 ul 上样染料,混匀。
(4)上样。
(5)电泳:电泳槽内加入1XMOPS缓冲液,于7.5 V/ml 的电压下电泳。
(6)电泳结束后,在紫外灯下检查结果。