一、在适合大小的RNase free离心管中加入1体积(<1.5 ml)加入各种抗凝剂新鲜血液 (颠倒混匀后)和3体积的红细胞裂解液RLB,颠倒混匀,可轻弹管壁,确保混匀。
二、室温放置10分钟(期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞)。
如果RNA降解严重,可在冰上裂解,但是时间可长一些以充分裂解。
三、12 000 rpm离心20秒,倒弃红色上清,并小心的尽可能多的吸弃上清(注意不要吸到管底的细胞团),留下完整的管底白细胞团。
离心后在管底应该见到白色的白细胞团,也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起,但是如果看到的是大部分的红色细胞团,说明红细胞裂解很不充分,应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤二、三。
上清尽可能的吸弃,残留过多会稀释裂解液,造成裂解结合异常,产量纯度降低。
四、涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬,加入350 μl(<0.5 ml全血)或者600 μl(0.5-1.5ml全血)裂解液RLT,吹打混匀后用手剧烈振荡20秒,充分裂解。病人血样中白细胞数量可能大幅增加,应该适当减少处理量。或者按照350 μl(<2x10
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白细胞)或者600 μl(2x10
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-1x10
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白细胞)比例加RTL。
五、用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9 mm针头) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。
六、较精确估计裂解物体积,加入等体积的70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。
七、立刻将混合物(每次小于700 μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)13 000 rpm离心60秒,弃掉废液。
八、加700 μl 去蛋白液RW1,室温放置30秒,12 000rpm 离心30秒,弃掉废液。
如果DNA残留明显,可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。
九、加入500 μl漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇),12 000 rpm 离心30秒,弃掉废液。加入500 μl漂洗液RW,重复一遍。
十、将吸附柱RA放回空收集管中,13 000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
十一、取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50 μl RNase freewater(事先在 70-80℃水浴中加热效果更好), 室温放置1分钟,12 000 rpm 离心1分钟。
十二、如果提取全血>0.5 ml或者>2x10
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白细胞,加30-50 μl RNase free water重复步骤十一,合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。
注意事项
1. 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇。
2. 使用前将10X红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到1X。
3. 操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%,如1 ml RLT 中加入10 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。