真核生物的mRNA 5′端有个帽子结构,3′端有长约200 bp 的poly(A)尾巴。据此特点,可设计一种与其互补的序列oligodT,为了把它锚定在poly(A)尾的起始端,将其设计成T12MN(M=A/C/G;N=A/T/C/G),这样T12MN 就有12种不同的组合。将T12MN 作为反转录引物,就可以将带有poly(A)尾的mRNA反转录为相应的cDNA,再用该引物锚定cDNA第二链的3′端,此时引入一随机引物进行PCR 扩增,由于随机引物随机结合在cDNA的互补靶位点上,源于不同mRNA的扩增片段其大小不同,因此经过PCR扩增的产物其大小也不同,通过电泳等技术显示在凝胶上,就可以检测到有差异的cDNA片段。经过验证其确实为特异片段,进而筛选cDNA文库或运用cDNA末端的快速扩增( Rapid Amplification of cDNA End,RACE)技术获得全长cDNA。
一、 材料准备
1. 标本
18例脊索瘤及其周围正常组织(距肿瘤5 cm以上)标本来自中国医科大学附属第一、二医院、辽宁省人民医院、沈阳市中心医院骨科,经病理切片确诊为脊索瘤,取材后立即置于液氮中速冻,然后贮存于-7O℃冰箱中备用。本研究中mRNA-DD试
验所用标本编号为15,采自中国医科大学附属第一医院(2000-10-20),60岁男性患者, 病理号为328874。
2. 引物
锚定引物(Anchored primer,HIEROGLYPH):
T7(dT12)AP8 5 ACGACTCACTATAGGGCrITITTrrrrrIT丌AA3
T7(dT12)AP11 5 ACGACTCACTATAGGGCTT1Tn T 几TIrrAT3
随机引物(Arbitrary primer,HIEROGLYPH):
M13r—ARP1: 5 ACAArITITCACACAGGACGACTCCAAG3
M 3r—ARP2:5 ACAArITITCACACAGGAGCTAGCATGG3
M13r—ARP3:5 ACAArITITCACACAGGAGACCATrGCA3
M13r—ARP4:5 ACAArITITCACACAGGAGATAGCAGAC3
二、
应用Trizol试剂(GIBCOBRL)提取总RNA。
三、
取1 μg总RNA,应用GIBCOBRL的反转录试剂盒进行反转录,PCR反应体系20 μl,引物为1_7(dT12)APs,条件见试剂盒。
四、DD-PCR扩增
引物为M13r-ARPs,体系为10 μl,PCR扩增条件为:95℃ 30 s,50℃ 40 s,72℃ 2 min,5个循环:95℃
30 s,60℃ 40 s,72℃ 2 min,31个循环。
五、产物检测
取3 μl产物进行8% 聚丙烯酰胺凝胶电泳(50℃ ,3000 V,100 W,4~5 h),GenomyxLRTM Fluores-cent Imaging Scanner扫描。然后将差异条带切下。
六、差异cDNA片段的纯化、测序、同源性比较与分析
差异条带重新进行PCR扩增, 扩增条件同DD-PCR,体系10.0 μl。将纯化的cDNA片段进行测序(上海生工生物工程技术公司),测序结果在互联网上进行同源性比较和分析。
七、 差异cDNA片段的验证
根据两个差异cDNA片段的测序结果,分别设计一对特异引物(扩增507 bp和448 bp两个片段),以相同脊索瘤患者的总RNA为模板,进行RT—PCR反应。两对特异引物的复性温度分别为58℃(cDNA1)和60℃(cDNA2),引物序列如下:
cDNA 1:TCTGCCACATCTrGGCCrITITCAACCTCTGCTFCCCAGGCT
cDNA2:AACAGCCCTCAGCATrGGCTATGCCCAGATGGAGCCTCTC
内对照所用B—actin(318 bp)引物序列如下:
MW 5,ATCATGrITITGAGACCTCCAACA3
MW 5 CATCTCTFGCTCGAAGTCCA3
PCR反应条件:94℃ 30 s,58℃~60℃ 30 s,72℃1.5 min,35个循环。2%琼脂糖凝胶电泳, 条件为80 V,60~90 min,自动凝胶电泳成像分析仪分析结果。
八、 差异cDNA片段与脊索瘤相关性的筛查
按照差异cDNA片段的验证实验所用方法,对剩余17例脊索瘤及其周围正常组织进行cDNA1和cDNA2两个差异片段的RT-PCR筛查。