独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶,植物RNA助提剂PLANTaid帮助结合多糖多酚并通过离心去除,然后用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
一、 新鲜植物组织称重后取100 mg迅速剪成小块放入研钵(冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取100 mg放入研钵), 加入10体积(1 ml)RLT(请确定已加入β-巯基乙醇)和1体积(100 μl) PLANTaid 室温下充分研磨成匀浆,注意应该迅速研磨让组织和裂解液RLT立刻充分接触以抑制RNA酶活性。
二、将裂解物转入离心管,剧烈摇晃振荡15秒,13 000 rpm离心5-10分钟,沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid,取450 μl裂解物上清转到一个新离心管。
三、加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。
四、将混合物(每次小于700 μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)13 000 rpm离心60秒,弃掉废液。
五、加700 μl 去蛋白液RW1,室温放置30秒,12 000 rpm 离心30秒,弃掉废液。
如果DNA残留明显,可在加入RW1后室温放置5分钟后再离心。
六、加入500 μl漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇),12 000 rpm 离心30秒,弃掉废液。加入500 μl漂洗液RW,重复一遍。
七、将吸附柱RA放回空收集管中,13 000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
八、取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50 μl RNase free water(事先在 70-90℃水浴中加热效果更好), 室温放置1分钟,12 000 rpm 离心1分钟。
九、如果预期RNA产量>30 μg,加30-50 μl RNase free water重复步骤7, 合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。
注意事项
1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13 000 rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2. 需要自备乙醇, β-巯基乙醇,一次性注射器(可选),研钵。
3. 裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4. 植物组织裂解是否充分直接影响到RNA 提取的质量和产量,本试剂盒中提供的裂解液RLT,主要成分为异硫氰酸胍,适用于大多数植物组织的裂解,但有些植物组织(例如玉米的乳白色胚乳)或丝状真菌,由于次级代谢产物较特殊,异硫氰酸胍使样品产生固化,导致RNA 无法提取,此时可以向我们索取另一种裂解液RLC,将解决该问题。
5. 关于DNA 的微量残留
一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留,本公司的EASYspin系列RNA提取产品,由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜,在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留(一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见)影响不是很大,如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时:
1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
3) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup),请联系我们索取具体操作说明书。
4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前,直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
6. RNA 纯度及浓度检测
完整性: RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE电泳缓冲液;150 v,15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA,电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2 kb,分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍,否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度:OD
260
/OD
280
比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA,OD
260
/OD
280
读数(10mMTris, pH7.5)在1.8-2.1 之间。OD
260
/OD
280
读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品,假定在10mM Tris,pH7.5 溶液中测出的OD
260
/OD
280
读数1.8-2.1 之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间,但这并不表示RNA 不纯。
浓度:取一定量的 RNA 提取物,用RNase-free 水稀释n 倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD
260
,OD
280
测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/μl)= (OD
260
)×(稀释倍数n)×40