采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单,但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同(主要是盐离子浓度不同)或反应温度不同,这时可以采用如下措施解决:1)先用一种酶切,然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切;2)先进行低盐要求的酶酶切,然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求,加入第二种酶进行酶切;3)使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行,尽量避免星号活力。
一、实验材料准备
1. 材料:质粒DNA。
2. 试剂:限制性内切酶、ddH
2
O。
3 . 仪器:微量移液枪,离心机,水浴锅, 电泳仪,紫外透射观测仪。
二、单酶切
1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入:
(1)质粒DNA:X μL(约1 μg)。
(2)限制性内切酶:1 μL(约10 U)。
(3)10×buffer:2 μL。
(4)ddH 2 O:补足20 μL。
1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入:
(1)质粒DNA:X μL(约1 μg)。
(2)限制性内切酶:1 μL(约10 U)。
(3)10×buffer:2 μL。
(4)ddH 2 O:补足20 μL。
2. 混匀,做好标记。
3. 37℃水浴1-3 h。
4. 70℃水浴10 min中止反应。
5. 电泳检测酶切效果。
三、双酶切
1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入:
(1)质粒DNA:X μL(约1 μg)。
(2)限制性内切酶1:1 μL(约10 U)。
(3)限制性内切酶2:1 μL(约10 U)
(3)10×buffer:1或2 μL。
(4)ddH 2 O:补足20 μL。
1. 在1.5 mL灭菌离心管中依次加入:
(1)质粒DNA:X μL(约1 μg)。
(2)限制性内切酶1:1 μL(约10 U)。
(3)限制性内切酶2:1 μL(约10 U)
(3)10×buffer:1或2 μL。
(4)ddH 2 O:补足20 μL。
2. 混匀,做好标记。
3. 37℃水浴1-3 h。
4. 70℃水浴10 min中止反应。
5. 电泳检测酶切效果。
四、结果与分析
假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底,紫外灯下检测电泳结果,则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样(超螺旋、线性和开环三条带),则说明质粒完全没有被切开。
注意事项
1. 酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系,这样抑制因素得以稀释;基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大,一般为1μg/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10,否则甘油浓度会超过5%,会产生星号活力;对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4―5hr, 甚至过夜。灭活限制性内切酶活性可以采用加热灭活,乙醇沉淀,酚/氯仿抽提,添加EDTA或SDS等方法,具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活,这一点需要注意。
2. 双酶切体系缓冲液添加量要根据两种限制性内切酶最佳缓冲体系,可以登录限制性内切酶购买公司官方查看。