独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶,植物RNA助提剂PLANTaid帮助结合多糖多酚并通过离心去除,然后用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除, 最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
一、取500 μl裂解液RLT(已经加入β-巯基乙醇),转入1.5 ml离心管中,加入50 μl PLANTaid混匀备用。
二、液氮中研磨适量植物组织成细粉后,取50 mg细粉转入上述装有RLT和PLANTaid的离心管,立即用手剧烈振荡20秒,充分裂解。
在56℃温育1-3分钟有助于裂解植物,但是淀粉含量高的植物不能温育,因为提高的温度可能导致淀粉膨胀。
三、用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9 mm针头) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。
四、将裂解物13,000rpm离心5-10分钟,沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid,将所有裂解物上清转到一个新离心管。
五、较精确估计裂解物(上清)体积,加入0.5体积的无水乙醇,此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。
六、将混合物(每次小于700 μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)13 000 rpm离心60秒,弃掉废液。
七、加700 μl 去蛋白液RW1,室温放置30秒,12 000 rpm 离心30秒,弃掉废液。
如果DNA残留明显,可在加入RW1后室温放置5分钟后再离心。
八、加入500 μl漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇),12 000 rpm 离心30秒,弃掉废液。加入500 μl漂洗液RW,重复一遍。
九、将吸附柱RA放回空收集管中,13 000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
十、取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50 μl RNase free water(事先在 70-90℃水浴中加热效果更好), 室温放置1分钟,12 000 rpm 离心1分钟。
十一、如果预期RNA产量>30 μg,加30-50 μl RNase free water重复步骤七,合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。