液氮研磨可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。
一、实验试剂准备
1. RNA提取缓冲液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100 mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC处理的水配置),25 mM EDTA,0.5 g/L 亚精胺Spermidine,2.0 M NaCl,2%巯基乙醇(V/V,使用前加入)。由于在高温灭菌条件下,Tris-HCl要和DEPC发生反应,所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC处理的水配制即可。
2. SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10 mM Tris-HCl pH8.0,1.0 mM EDTA。
3. 10 M LiCl 直接用蒸馏水配10 M LiCl,加1‰的DEPC过夜后,高温灭菌。
4. DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜,高温灭菌。
5. 3M NaAc,氯仿:异戊醇(24:1),酚(pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1),无水乙醇,70%酒精。
二、实验步骤
1. 实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10 mL加80 ul,50 mL中加入300 ul)。
2. 取约0.8 g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可,固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8 mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀。
3. 65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次。
4. 加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(10 000 rpm,4℃,5 min)。
5. 取上清,等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提(10 000 rpm,4℃,5 min)。
6. 加入1/4V体积10 M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)。
7. 10 000 rpm,4℃离心20 min。
8. 弃上清,用500 ul SSTE溶解沉淀。
8. 弃上清,用500 ul SSTE溶解沉淀。
9. 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提两次,氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10 000 rpm,4℃,5 min)。
10. 加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30 min以上。
11. 12 000 rpm,4℃离心20 min。
12. 弃上清。沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥。
13. 加200 ul的DEPC处理水溶解。
14. 用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数。)
注意事项
1. 提取RNA请尽量在低温下操作,如果条件不容许,在室温下操作的时间要尽可能的短。