1. 培养100 ml 大肠杆菌或500 ml 蓝细菌至对数生长期,加入1/20体积终止缓冲液,置于冰上。
2. 于4℃用JA-10转子17 700 g 离心5 min 收集细胞。
3. 用2 ml STET裂解液重悬细胞,加入100 μl 0.2 mol/l 的VRC,移入15 ml 聚丙烯管子。
4. 加入1 ml 缓冲液平衡酚,振荡1 min 再加1 ml 氯仿,振荡1 min,于4℃用JA-17转子10 000 g 离心10 min,收集水相。
5. 加入1/10体积3 mol/l 乙酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇,于4℃ 10 000 g 离心10 min。
6. 用2 ml 0.2 mol/l VRC溶液重溶沉淀。
7. 用1:1酚/氯仿抽提2遍后,按步骤5重新沉淀。
8. 如用TLA-100.3转子
(1)重溶沉淀于2 ml DEPC处理水中,加1 g 固体CsCl并使之完全溶解。
(2)取2.25 ml 加在13 mm ×51 mm TLA-100.3聚碳酸酯超离心管的0.75 ml CsCl垫层之上,于20℃ 280 000 g 离心1 h。
9. 如用SW-41转子
(1)重溶沉淀于6 ml DEPC处理水中,加入4.5 g 固体CsCl并使之完全溶解。
(2)补加DEPC处理水至9 ml,并将其加在14 mm×89 mm Ultraclear超离心管的3 ml CsCl垫层之上,于20℃150 000 g 离心24 h。
10. 用无菌巴斯德吸管小心地移去界面的DNA层,然后移去上层CsCl液,倾去残余液体,作一记号标记RNA沉淀的所在。
11. 用纸巾擦干离心管壁,沉淀用0.36 ml DEPC处理水重溶并移至1.5 ml 的微量离心管中。
(1)重溶沉淀于2 ml DEPC处理水中,加1 g 固体CsCl并使之完全溶解。
(2)取2.25 ml 加在13 mm ×51 mm TLA-100.3聚碳酸酯超离心管的0.75 ml CsCl垫层之上,于20℃ 280 000 g 离心1 h。
9. 如用SW-41转子
(1)重溶沉淀于6 ml DEPC处理水中,加入4.5 g 固体CsCl并使之完全溶解。
(2)补加DEPC处理水至9 ml,并将其加在14 mm×89 mm Ultraclear超离心管的3 ml CsCl垫层之上,于20℃150 000 g 离心24 h。
10. 用无菌巴斯德吸管小心地移去界面的DNA层,然后移去上层CsCl液,倾去残余液体,作一记号标记RNA沉淀的所在。
11. 用纸巾擦干离心管壁,沉淀用0.36 ml DEPC处理水重溶并移至1.5 ml 的微量离心管中。
12. 加入1/10体3 mol/l 乙酸钠和2.5倍体积冰冷无水乙醇,于-70℃沉淀20 min,于4 ℃用微量离心机高速离心5 min。
13. RNA沉淀加入1 ml 冰冷70%乙醇,再于4℃用微量离心机高速离心5 min。
13. RNA沉淀加入1 ml 冰冷70%乙醇,再于4℃用微量离心机高速离心5 min。
14. 晾干沉淀,并溶解于200 μl DEPC处理过的水,测A
260
和A
280
定量RNA。
15. 最后调节浓度至4 μg/μl,于-70℃长期保存或以乙醇沉淀的形式保存。
15. 最后调节浓度至4 μg/μl,于-70℃长期保存或以乙醇沉淀的形式保存。