一、生物素标记的Oligo(dT)探针与mRNA的煺火
1. 在DEPC处理过的1.5 ml Eppendof管中,加入0.2-1 mg 的总RNA和无RNase的水至终体积为0.5 ml。
2. 65℃加热10 min。
3. 加入2 μl 生物素标记的Oligo(dT)探针和12 μl 的20×SSC于RNA中轻轻混匀,室温放置,逐渐冷却平衡至室温,此步操作一般需10 min。
二、亲和素顺磁磁珠(SA-PMPS)的冲洗
1. 将SA-PMPS轻晃开后,放入磁性分离架中,使SA-PMPS集中于试管一则(约30秒), 小心去除上清(不用离心方法)用1.5 ml 0.5×SSC漂洗SA-PMPS,用磁性分离架集中磁珠, 去除上清,漂洗3次。
2. 将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2 ml 0.5×SSC中。 杂交体的生成及漂洗。
3. 将上步“3”中褪火的生物素标记的Oligo(dT)探针,全部加到上步“5”管中,轻轻混匀,室温放置10 min。每隔2分钟轻轻混匀一次。
4. 用磁性分离架捕获磁珠,吸弃上清。
5. 用0.3 ml 0.1×SSC漂洗SA-PMPS,用磁性分离架集中磁珠,吸弃上清,漂洗4次。
三、洗涤收集mRNA
1. 将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2 ml DEPC水中。
2. 用磁性分离架捕获磁珠,将洗脱的水相吸至一新管中。重复洗涤一次,吸取水相,两次水相合并(约0.25 ml)
3. 在洗脱液中加入0.1体积的NaAC,1体积的异丙醇,-20℃沉淀过夜,12 000 g 离心10 min,75%乙醇洗沉淀,真空干燥。
4. 提取mRNA质量的分光光度计检测,将所提mRAN分别在260,280 nm 比色,要求A. OD260%/ OD280%不小于2.0及40 μg 所提样品在OD260%的值为1 。
5. 提取mRNA质量的电泳检测,在1%的变性胶上,EB染色后,mRNA应在0.5-8 Kb 间均匀着色,1.5-2 Kb 间着色较强。