氯仿 异丙醇 75%乙醇(用DEPC水配制) 无RNase的水(将水加入无 RNase 的玻璃瓶内,加浓度为0.1 % ( V/V)的DEPC过夜 ,尚压灭菌) 0.5%SDS溶液(必须DEPC处理过的高压灭菌水配制 ) TRIzol 试剂
1 . 匀浆
1 ) 组织:每 50〜lO mg组织,加入1ml TRIzol试剂,用玻璃 -Teflcm 或电动匀浆器勾浆。样本体积不能超过 TRIzol 试剂的10%
2 ) 单层培养细胞:在 3. 5cm 的培养皿中加入 1ml TRIzol 试剂•用吸管抽吸细胞多次,直接裂解细胞。加入TRizol试剂的量取决于培养皿的大小(1ml/10cm^2)而不取决于细胞的量。TRIZol 试剂的量若不足,分离的 RNA 易受 DNA 污染。
3 ) 悬浮细胞:离心收集细胞,加 入 TRIzol 试剂屮反复吹打裂解细胞。动物,植物,酵母每 5X10^6~10×10^6 个细胞用lm] TRIzol 试剂。加 TRIzol 试剂前请勿洗涤细胞,因为这样会增加RNA的降解。可用勻浆器裂解细荫和酵母细胞。
2 . 相的分离
1 ) 匀浆后于 15 〜30 ℃放置 5min,以保证核蛋白复合体完全分离。
2 ) 加入 0.2m l 氯仿 /lm l TRIzol试剂。盖好样本管于 15 〜30℃用手剧烈摇动 15s ,放置 2〜3min。于2〜8° C小于12 000 g 离心 10mm。离心后、混合物分为三相:即最下层红色的酚-氯仿相,中间相以及上层水相&RNA绝大多数留于水相,水相体积用于匀浆的 TRlzol 试剂体积的 60%。
3. R N A 沉淀
1 ) 将水相移至一新管(若要分离DNA或蛋白质,保留有机相),加人异丙醇,混合均匀,以沉淀 RNA。每1ml TRizol试剂加入0.5ml 异丙醇,于 15〜30℃ 放置 10min
2)于2 〜8℃小于12000 g 离心 10min. 离心前,常看不到RNA沉淀,离心后 RNA 形成胶状颗粒物.沉枳在管的底部和壁上。
4. R N A 洗涤
1 ) 移去上清液,用 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀一次,每 1mlTRIzol 试剂至少加入加入1ml7 5 % 乙醇混匀,于2〜8℃7500g 离心5min。
2 )弃上清
5.RNA溶解
1) RNA沉淀空气干燥 5〜l O min。勿在真空状态下离心干燥RNA,并注意勿使 RNA 完全干燥,因为这会大大降低其溶解性。若RNA未完全溶解,其 A260/280 <1.6
2 ) 加入不含 RNase 的水或 0, 5%SDS 溶液,反复吹打以溶解RNAg 如RNA较难溶解,可于 55〜60C 助溶 10min
2)A260/280<1.65 其原因可能有以下几点:样本太少;匀浆后,标本未室温放置水相受酚污染;RNA 沉淀未完全溶解。
3) RNA 降解:其原因可能有以下几点:从动物中取出的组织未立即加工或冻存;分离RNA的样本储存于 -5〜一20° C ,而不是一60〜一70℃:; 细胞被胰酶消化;溶液或管中含有 RNase;用于琼脂糖凝胶电泳的甲醛 PH < 3.L
4) DNA 污染:其原因可能有以下几点:样本太少;用于分离的样本含有机溶剂如乙醇、DMSO) 虽缓冲液或碱性溶液。
5 ) 蛋白多糖和多糖的污染:下列改进的 R N A 沉淀法(步骤3 ) , 可从分离的RNA中去除这些污染物。水相中每毫升 TRIzolml 加入0. 25m l异 丙醇,再加 0. 25m l 卨盐沉淀液 (0.8mol/ L 柠檬酸钠 1.2mol/LNaCl) ,混合,离心,如前所述。这样可有效沉淀RNA 而蛋白多糖和多糖则留在液相。
6 ) 从少量样本(细胞≤14^4或组织≤10 mg)中提取RMA时,加入 0. 8mlTRIzol 试剂,匀浆后,加入氯仿,进行 RNA的分离,如步骤2。用异丙醇沉淀RNA前,加入 5〜10 微克无RNase的糖原。
7 ) 若样本中含有高浓度的蛋白质J 旨肪.多糖或细胞外物质,肌肉、脂肪组织、植物茎块,则需进行额外的分离。匀浆后,2〜12 000g 离心10mm, 将不溶性物质去除所得的沉淀包含有细胞外膜、多糖和髙分子质量的 DNA,上清液则含有RNA。来自脂肪组织的样本,脂肪聚集在上层,可去除.将处理好的匀浆液移至新管,如上所述,加氯仿进行液相分离.
8)匀浆后加氯仿前样本可于 -60〜一70℃ 储存至少一个月。RNA沉淀可在75%乙醇 中 2〜8℃ 放置至少一个星期,一5〜一20 摄氏度至少放置一年。
9 ) 若在步骤2 ) 、3 )中,离心转速为 2600g,时间需增加到 20〜30min。
10) TRIzol试剂有毒,若与皮肤接触后,用清洗剂充分水洗。若感觉不适,应速去医院。TRIzol 试剂储存于 2〜8℃若室温储存,有效期为 12 个月。