cDNA第一链的合成:
1.在Ependorf管中加50pmol/L的一种α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl(10μg),100m mol/L甲基氢氧化汞1μl,室温反应l0分钟,使RNA变性.
2.加100m mol/l的β-巯基乙醇2μl和10m mol/l RNase抑制剂2μl,室温放置5分钟.β-巯基乙醇有稳定逆转录酶活性的作用.
3.向上述反应混合物加lmg/ml的引物01igo dT(12~18聚体)10μl,1mol/l Tris.HCl(pH8.3)5μl,11mol/l, KCl7μl,250m mol/l,MgCl
2
2μl,再加20 m mol/l的4种dNTP各2.5μl,逆转录酶2μl(40单位),用水补充到50μl,充分混匀,42℃反应1~3小时.
4.加0.5 EDTA(pH8.0)2μl终止反应,然后加150m mol/l NaOH 25μl,65℃反应1小时,或37℃8小时,水解mRNA模板,得到cDNA第一链,再加pH8.0,1m mol/l Tris.HCl,各25μl中和其pH.
5.测定放射活性,计算合成的DNA量.实际上,cDNA第一链的产量往往不会超过poltAmRNA用量的10%~30%.
6.用等体积的酚-氯仿抽提—次,取水相并用SephadexG-100离心柱层析将cDNA同剩余的dNTP分开,以2.5倍体积的95%冷乙醇沉淀.
7.合成的cDNA第—链在1.4%的碱性琼脂糖凝胶上电泳,用末端标记的pBR322限制性片段为分子量标准,电泳后,铺X-光片,进行放射自显影,确定cDNA第一链的大小.
cDNA第二链的合成:
1.离心沉淀cDNA第一链,并重悬在50μl水中,加50μl 2×第二链缓冲液(0.2mol/l Hepes,pH6.9,20m mol/l MgCl
2
,5 m mol/l DTT,0.14 mol/l KCl,1 m mol/l 4种Dntp),混合均匀.
2.每微克底物加大肠杆菌DNA聚合酶K1enow片段20~50单位,15℃反应20小时,此酶能识别cDNA 3’末端发卡环,并以其为引物,cDNA第一链为模板,开始第二链的合成.
3.加0.5 mol/l EDTA 2μl终止反应.取样电泳,以提取第一链同样的方法分离沉淀dsDNA.对于这样合成的dsDNA不是全长的DNA分子,所以,需要进一步用逆转录酶合成.
4.溶解上述dsDNA在20μl水中,再加入:1mol/l Tris.HCl pH8.3)5μl,1 mol/l KCl 7μl,250m mol/l MgCl
2
2μl,20m mol/l 4种‘dNTP各2.5μl,700m mol/l β-MCE 2μl,加重煎水到48μl,加逆转录酶2μl (40单位)、42℃保温反应1小时.
5.加0.5 mol/l EDTA 2μl终止反应,取样电泳,以同样方法抽提,分离沉淀dsDNA.
6.用两次合成的双链cDNA和单链cDNA在1.4%碱性琼脂糖凝胶上电泳,放射自显影后观察,如果dsDNA片段的长度是第一链cDNA的两倍,那么,合成便是成功的.
7.用核酸酶S1消化dsDNA,除去连接两条链的发卡环.