冰冷的磷酸盐缓冲液 (PBS) 137 mmol/L NaCl 2.7 mmol/ l KCl 4.3 mmol/l Na2HP04•7 H20 1.4 mmoI/L KH2PO4 pH7.3 冰冷的裂解缓冲液:50mmcil/LTris-HCl pH 8.0 lOOmmoL/L NaCl 5 mmoL/LMgCL21) 0.5%(V/V )NkmidetP-40 1000U/ml 胎盘 RNase 抑制剂如 :RNasin 及 1 mmol/lDTT,用 DEPC 处理的水配制,过滤除菌 20% SDS 20 mg/ml 蛋白酶 K 酚 :氯 仿:异戊醇 (25 : 24 : 1) 3mo]/L 乙酸钠 (DEPC 处理)pH 5.2 无水乙醇 75%乙醇/25% 0.lmoL/L 乙酸钠,pH 5.2 DEPC 处理的水
1) 收集细胞:①对于贴壁细胞,每 10 cm 的培养皿用 I ml 冰冷的 PBS 洗三次,再以小体积的 PBS 刮下细胞并转移到离心管中 ( 置于冰丄)3 00 g 离心 5 min 去上淸,冰上放置。
②对于悬浮细胞,以 3 0 0 g 离心 5m i n 收集细胞,去上清。再用一半体积冰冷的 PBS
重悬细胞,按前述方法离心并去上清。
2) 以 375 ul 冰冷的裂解缓冲液重悬细胞,冰上孵 5 min。在 _4℃ 用微型离心机离心
2 min 上清转移至一装有 4ul 20% SDS 的管中,立即振荡混匀。
3)加人 2.5ul 20 mg/ ml 的蛋白酶 K , 37℃ 温育 5 min
4 ) 加人 400ul 酚:氯仿:异戊醇,振摇 Imin。离心,上层水相转移至一干净管中,重
复抽提一次,再用 400ul 氯仿:异戊醇抽提一次. 上: 层水相转移至一干净管中。
5 ) 加人 40ul 3mol/l 乙酸钠 (pH5.2 ) 和 lm l 无水乙醇, 混合,冰上沉淀; 15〜30 min 或 一20 ℃ 沉淀过夜。
6) 于 4℃ 以 12 00 g 离心 15 min 。再用 1 ml 75% 乙醇/ 25½ 0.l mol / 1 乙酸钠
( PH 5.2 ) 洗涤沉淀。干燥后溶于 100ul DEPC 水中。取出一小份测定其浓度及纯度,其
余负 70℃ 保存
A260/080 应该在 1. 7〜2 . 0 之间。
2 ) 第二步操作重悬细胞时要小心操作,避免起泡沫,, 待悬液迅速变清,则显示细胞裂解完成。
3 ) 如果所收集的细胞转染过 DNA,可用无 RNase 的 DNase I 消化去掉污染的
DNA , 再按前述的方法用酚:氯仿:异戊醇及氯仿:异戊醇抽提回收 RN A 。