用GM I和GM II溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a,用改进的方法制备感受态细胞。
一、实验材料准备
1. 枯草芽孢杆菌感受态制备用贮存液
(1)10×Spizizen salts母液: 15% K
2
HPO
4
·3H
2
O,6% KH
2
PO
4
,2% (NH
4
)
2
SO
4
,0.2% MgSO
4
,1% 柠檬酸钠,溶于蒸馏水中,6.6 ×10
4
Pa高压灭菌,室温贮存。
(2)10% 酵母粉、1% 水解酪蛋白和25 mmo l /L MgCl
2
, 6.6 ×10
4
Pa高压灭菌, 酵母粉溶液最好现用现配,水解酪蛋白和
MgCl 2 溶液可室温贮存;20%葡萄糖、0.25% 所需氨基酸和0.1 mo l/L CaCl 2 ,用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌,葡萄糖溶液和CaCl 2
MgCl 2 溶液可室温贮存;20%葡萄糖、0.25% 所需氨基酸和0.1 mo l/L CaCl 2 ,用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌,葡萄糖溶液和CaCl 2
溶液室温贮存, 氨基酸溶液- 20℃ 贮存。
2. 枯草芽孢杆菌感受态制备用培养基
(1)GM I:1mL 10 ×Spizizen salts, 0.1 mL,10% 酵母粉,0.25 mL 20% 葡萄糖,0.2 mL 1% 水解酪蛋白,0.2 mL 0.25%所需氨基酸,补充灭菌蒸馏水至总体积10 mL。
(2)GM II:1 mL 10×Spizizen salts,0.05 mL10%酵母粉, 0.25 mL 20% 葡萄糖,0.04 mL 1% 水解酪蛋白,0.2 mL 0.25%所需氨基酸, 0.05 mL 0.1mo l/L CaCl
2
, 1 mL 25 mmo l/L MgCl
2
, 补充灭菌蒸馏水至总体积10mL。
二、实验步骤
1. 挑取一新鲜培养的野生型枯草芽孢杆菌菌株BS501a菌落接种于2.5 mL GMI培养基中,30℃,130-150 r/min振荡培养过夜。
2. 将过夜培养物按10%接种量接种于2.5 mL新鲜的GM I中,37℃,200- 230 r/min振荡培养3.5h。
3. 再将培养物进行第二次传代, 接种于5 mL GMII培养基中,野生型菌株BS501a按5% 接种量进行第二次传代,37℃,200-230 r/min振荡培养90 min。
4. 取1mL培养物,5 000 r/min室温离心5 min,用1 /10体积上清液重新悬浮细菌沉淀,即为枯草芽孢杆菌感受态细胞。