一、试剂配制
1 mM HEPES的配制:称取0.119 g HEPES(MW 238.3)粉末,加水溶解,定容至500 ml,用NaOH调pH至7.0,灭菌后待用。
二、实验步骤
1. 挑取单克隆接种于2 ml YEP(含50 mg/l链霉素)液体培养基,28℃,250 rpm,振荡培养过夜。(如用5 mlYEP,需培养36 h)
2. 将菌液按1:100转移至200 ml YEP(含50 mg/l链霉素)培养液中,28℃,250 rpm,振荡培养至OD=0.3(约4~5 h)。
3. 转入50 ml的无菌离心管,4℃,4 000 rpm离心10 min,弃上清。
4. 用20 ml冰浴的HEPES(1 mM,PH7.0)重悬。
5. 4℃,4 000 rpm离心10 min,弃上清。
6. 重复4、5步骤2~3次。
7. 用2 ml冰浴的10%甘油重悬。
8. 每管100 μl分装于1.5 ml无菌的Eppendorf管中,-70℃保存。
注意事项
1. HEPES需现用现配。