原位PCR是原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术,使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞(爬片、甩片或涂片)或组织(石蜡、冰冻切片)上直接对靶基因片段进行扩增,通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。
一、组织切片和细胞样品的制备
1. 试剂与配置
10%福尔马林;二甲苯;PBS。
2. 操作方法
(1)用10%福尔马林固定组织8~15 h,石蜡包埋,切片(4 μm),将切片置于新鲜的二甲苯中处理5 min,放入无水乙醇中浸泡5 min,取出,空气干燥;
(2) 对于培养细胞,可直接制备爬片,也可有PBS洗细胞一次,加10%福尔马林静置过夜,用橡胶刮下细胞;用PBS洗细胞两次,2 000 rpm×3 min,用5 ml PBS重悬细胞,即可用甩片机甩片或直接吸50 μl点在载玻片上。
二、切片预处理(蛋白酶消化)
1. 试剂与配置
0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)
缓冲液A:0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4),0.3% Tween-20,0.5% NP-40
蛋白酶K:20-50μ g/ml,溶于TE中
2. 操作方法
(1)干燥后的切片置于0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)中,室温孵育5 min;
(2)浸入缓冲液A中,室温孵育10 min;
(3) 滴加20 μl蛋白酶K液于标本上,在湿盒中37℃孵育20 min;
(4)在室温下,用0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)漂洗两次,每次5m in。
三、原位扩增(以标记生物素为例)
1. 试剂与配置
PCR反应缓冲液:两种引物各100pmol,dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μmol, Bio-dUTP 50mol,1×PCR缓冲液;
Tag酶:5U/μl
缓冲液B:0.01mol/L PBS,0.1% Triton-X100
指甲油(市售)
无水乙醇
2. 操作方法
(1)切片用1×PCR缓冲液平衡3次,每次5 min;
(2) 用滤纸吸去切片上多余的液体,置60℃,每片加入30 μl PCR反应缓冲液,5 U Tag酶,用盖玻片封片,四周封以指甲油,防止蒸发;
(3) 94℃变性5 min,按下列条件(94℃×2 min,55℃×2 min,72℃×3 min)循环20~25次后,72℃延伸5 min;
(4)玻片浸入无水乙醇中10 min,以软化指甲油;
(5) 用刀片撬开盖玻片并除去;
(6) 用缓冲液B漂洗两次,每次3 min;
(7)用无水乙醇固定5 min,并吹干。
四、检测(以ABC法为例)
1. 试剂与配置
缓冲液C:0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.5),0.1 mol/LNaCl,2 mmol/L MgCl
2
, 0.5% Triton-X100
封闭液:3%BSA(溶于缓冲液C中)
显色液:0.05%DAB,溶于0.05 mol/L Tris-HCl (pH7.4),临用前每10 ml加30%过氧化氢50 μl。
1%盐酸酒精液
苏木素染色液
2. 操作方法
(1) 用30 μl 3%BSA滴加在玻片上,封闭1 h;
(2)用缓冲液C简洗1 min,每片滴加ABC复合物20~30 μl,室温放置40 min;
(3)缓冲液B室温漂洗3次,每次15 min;
(4) 滴加显色液于玻片上,镜下观察控制显色时间(一般7~14 min);
(5)流水洗片,浸入苏木素液中复染30 s,1%盐酸酒精分化(提抽2次);
(6) 常规脱水、透明、封片,镜下观察。