1. 准备两个小量预试验以确定最佳裂解反应条件:
(1)反应1:20 μl 1 mg/ml 融合蛋白溶液(在合适的缓冲液中)及0.2 μg 凝血酶。
(2)反应2:5 μl 1 mg/ml 融合蛋白溶液(模拟消化),25℃下温育反应。
2. 在30 min、1 h、2 h 和4 h 等时刻从反应1中分别取出5 μl 反应液与5 μl 2×SDS样品缓冲液混匀,-20℃冷冻。
3. 在4 h,往反应2(摸拟消化)中加入5 μl 2×SDS样品缓冲液。
4. 将5 μl 原始的融合蛋白溶液与5 μl 2×SDS样品缓冲液混匀。
5. 将所有样品煮沸10 min,加样于SDS-聚丙烯酰氨凝胶上分析样品的稳定性以及裂解的效率。
5. 将所有样品煮沸10 min,加样于SDS-聚丙烯酰氨凝胶上分析样品的稳定性以及裂解的效率。
6. 采用试验所得的最佳融合蛋白裂解条件,按比例任意扩大蛋白裂解反应。