1. 在一个高压过的微量离心管中建立20 μl 的反应复合物如下:
(1)4 μl 5×转录缓冲液
(2)1 μl 200 mmol/的3NTP混合液
(3)10 μl [α- 32 P]CTP
(4)1 μl 胎盘核酸酶抑制剂
(5)1 μl 1 mg/ml 模板DNA
(6)1 μl 噬菌体RNA聚合酶
(7)SP6 RNA聚合酶反应时在40℃保温30~60 min。采用T7或T3 RNA聚合酶则在37℃温育。
2. 加人5 μg 或10 U 无RNA酶的酶 I,37℃温育15 min。
3. 加入2 μl 10 mg/ml 的tRNA,补水至50 μl,以酚/氯仿/异戊酵抽提。
4. 水相加入200 μl,2.5 mol/l 乙酸铵和750 μl 无水乙醇,混匀后在冰浴饭置15 min,于4℃在微量离心机中离心15 min。
3. 加入2 μl 10 mg/ml 的tRNA,补水至50 μl,以酚/氯仿/异戊酵抽提。
4. 水相加入200 μl,2.5 mol/l 乙酸铵和750 μl 无水乙醇,混匀后在冰浴饭置15 min,于4℃在微量离心机中离心15 min。
5. 重溶于50 μl 水,按第4步操作所述重新沉淀两次,最后得到的沉淀以75%乙醇/25% 0.1 mol/l pH5.2的乙酸钠缓冲液洗涤,晾干沉淀并溶解于100 μl 杂交液,取1 μl 计数。
6. RNA以乙醇沉淀,并溶解于30 μl 含5×10
5
cpm RNA探针的杂交液中,于85℃加热变性5 min,移至设定的杂交温度(30~60℃),温育8 h 以上。
7. 加入350 μl 含40 μg/ml 的核酸酶A和2 μg/ml 核酸酶T1的核酸酶消化缓冲液,于30℃温育30~60 min。
8. 加入10 μl 20%SDS和2.5 μl 20 μg/ml 的蛋白酶K,37℃温育30~60 min。
9. 用400 μl 酚/氯仿/异戊醇抽提,水相移入含1 μl 10 mg/ml tRNA的离心管中,加入1 ml 乙醇沉淀,晾干后溶解于3~5 μl RNA加样缓冲液中。
10. 于85℃加热变性3 min,在变性的聚丙烯酰胺/尿素凝胶(序列胶)中电泳,用增感屏放射自显影过夜,分析结果。
7. 加入350 μl 含40 μg/ml 的核酸酶A和2 μg/ml 核酸酶T1的核酸酶消化缓冲液,于30℃温育30~60 min。
8. 加入10 μl 20%SDS和2.5 μl 20 μg/ml 的蛋白酶K,37℃温育30~60 min。
9. 用400 μl 酚/氯仿/异戊醇抽提,水相移入含1 μl 10 mg/ml tRNA的离心管中,加入1 ml 乙醇沉淀,晾干后溶解于3~5 μl RNA加样缓冲液中。
10. 于85℃加热变性3 min,在变性的聚丙烯酰胺/尿素凝胶(序列胶)中电泳,用增感屏放射自显影过夜,分析结果。