1. 样品提取
取充分均质的组织样品10 g于100 mL玻璃离心管中,加入20 mL 0.1 mol/L乙酸缓冲溶液,20 mg葡萄糖醛酸酶和蛋白酶,于均质器上均质1 min,置于培养箱中60培养1 min。冷却后加入15 mL 200 g/L三氯乙酸(采用广范围试纸,调pH1.5),在超声水浴上超声10 min。将提取液于10/15 ℃,4000 g离心15 min,若仍然存在悬浮物,温度可降低至8 ℃。倾出上清液,用20%氢氧化钾溶液调整pH至5.8~6.2,若在中和过程中出现沉淀,应进行过滤或再次离心。用200 g/L三氯乙酸淋洗电极,并入溶液中,并使总体积接近500 mL。移取20 mL 上述溶液于ISOLUTE HM-N柱中,平衡20 min。制备两份20 mL溶液,每份加入30 mL甲基叔丁基醚-环己烷(8 + 2),于100 mL硅烷化梨形瓶中,减压250 mbar,50 ℃旋转蒸发至干。
2. 净化
将ISOLUTE-Si汾置于SPE装置上,预先按顺序加4 mL乙酸乙酯,4 mL乙酸乙酯-甲苯(20 + 80),抽干。用2 mL乙酸乙酯-甲苯(20 + 80)溶解残渣,超声振荡,转移入柱。然后以4 mL乙酸乙酯-甲苯(20 + 80)淋洗,弃去淋洗液。用4 mL乙酸乙酯-甲苯(65 + 35)洗脱并收集氯霉素组分。
2. 衍生化
收集溶液于40 ℃在缓慢氮气流下吹干。用200 uL乙酸乙酯转移入反应小瓶,加入20 uL内标溶液m-CAP,再次于40 ℃在缓慢氮气流下吹干。加入50 uL BSTFA-TMCS(99 + 1)溶液,用内衬聚四氟乙烯(PTFE)的螺旋盖盖紧,于60 ℃反应l h。冷却后,在氮气流下缓慢吹干。加入25uL异辛烷溶解残渣。供GC-MS测定。
3. 仪器条件
色谱柱:5%苯基、95%甲基硅氧烷,30 m×0.25 mm×0.25um;
柱温:程序升温,60 ℃(l min),以40 ℃/min,升至 l80 ℃ ,以8 ℃/min, 升至280 ℃,以5 ℃/min,升至300 ℃;
进样方式:脉冲,无分流;
进样器温度: 270 ℃ ;
载气:氦气;
接口温度:300 ℃;
离子源温度:l85 ℃;
NCI离子化模式;
反应气:甲烷,压力为533 Pa(4000mTorr);
碰撞气:氩气,压力为0.27 Pa(2mTorr);
电子能量: 200 eV;
碰撞电流: 200 mA;
CAP:m/z 466(70)、468(70)、376(30)、378(30);
内标:m/z 47l(70)。