1. 前处理
称取10 g样品,准确加入内标溶液(13C-己烯雌酚、13C-睾酮、13C-雌二醇)(20 ng/mL)0.5 mL,加入10 mL pH5.2的乙酸钠-乙酸缓冲溶液,匀浆后,再加入β-葡萄糖酸苷酶-硫酸酯酶溶液10 uL,于(37±1)℃振荡酶解过夜。取出冷却后,加入36 mL甲醇振荡提取30 min,转入离心管2000 g离心10 min。上清液中加入40 mL正己烷提取两次,弃去正己烷层。水-甲醇层中加入0.5 mL正丙醇,50 ℃旋转蒸发去掉甲醇。
HLB固相萃取柱(6 mL, 500 mg)用6 mL甲醇、6 mL水活化。将旋转蒸发后溶液中加入50 mL水,以2~3 mL/min的速度过柱,用6 mL水洗潘后,萃取柱用氮气吹干。用10 mL 5 mmol/L三乙胺甲醇溶液洗脱,洗脱液氮气吹干,加入0.3 mL三氯甲烷溶解残渣,再加入3 mL正己烷用于下一步净化。
桂胶固相萃取柱(6 mL,500 mg)用6 mL正己烷活化,溶液过柱,用5 mL正己烷洗涤。用6 mL水饱和乙酸乙酯洗脱,洗脱液氮气吹干,用2 mL甲醇-乙酸乙酯(40 + 60)溶液溶解,以备过氨基柱。
氨基柱(6 mL,500 mg)用3 mL甲醇-乙酸乙酯(40 + 60)溶液洗涤,3 mL水饱和乙酸乙酯活化,将上步溶液过柱并接收,再加入3 mL甲醇-乙酸乙酯(40 + 60)溶液洗脱接收,氮气吹干后,加入0.5 mL流动相溶解上机测定。
2. 测定
(1)雄激素测定液相色谱条件色谱柱:苯基柱(2.0 × 250 mm,5 um);流动相:甲醇-水,梯度淋洗,初始条件为65%水-35%甲醇,保持3 min,27 min线性梯度使甲醇比例为100%,保持5 min,1 min内甲醇比例降到35%,保持20 min到下次进样。流速:0.2 mL/min。
(2)雄激素测定质谱参考条件电离源:电喷雾正离子模式;毛细管电压:3.5 KV;锥孔电压:70 V;射频透镜1电压:30 V;射频透镜2电压:0.5 V;源温度:100 ℃;脱溶剂气温度:300 ℃;脱溶剂气流量:400 L/h;电子倍增电压:650 V;喷撞室压力:2.8 × 10-3 mbar;
(3)雌激素测定液相条件色谱柱:苯基柱(2.0 mm × 250 mm, 5 um);流动相:乙腈-水,梯度淋洗,初始条件为65%水-35%乙腈,保持3 min,27 min线性梯度使乙腈比例为100%,保持5 min,1 min内乙腈比例降到35%,保持20 min到下次进样。流速:0.2 mL/min
(4)雌激素测定质谱条件电离源:电喷雾负离子模式;毛细管电压:3.1 KV;维孔电压:80 V;射频透镜1电压:40 V;射频透镜2电压:0.5V;源温度:100 ℃;脱溶剂气温度:300 ℃;脱溶剂气流量:400 L/h;电子倍增电压:650 V;喷撞室压力:2.8 × 10-3 mbar。