将小鼠的成纤维细胞(MEF)从机体中取出,经胰酶、螯合剂(常用EDTA)处理,分散成单细胞,置MEF生长培养基培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、取得小鼠胚胎
1.
性成熟母小鼠与种公鼠按1公(♂):2母(♀)比例合笼。
2.
每天早上观察母小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物(阴道栓)即确定为怀孕。见栓当天上午定为怀孕的0.5d。
3.
取怀孕12.5~14.5 d母鼠,断颈处死,无菌条件下暴露子宫。
4. 用镊子提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角。
4. 用镊子提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角。
5.
取出整个子宫,置于有PBS的平皿内。用PBS洗涤三次,弃除表面残余血迹。
6.
沿子宫系膜侧剪开子宫,取出带有胎膜的胚胎,置于另一盛有PBS的平皿内,充分洗涤,弃除表面红细胞。
7.
用小镊子撕破胎膜,取出胎鼠,弃除胎膜,用PBS洗涤三次。
8.
去除胚胎头部、内脏和四肢,将躯干部置于另一盛有PBS的平皿内,用PBS至少洗涤三次,充分弃除红细胞。
二、取得小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)
1.
用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm3以下的碎块,吸置于离心管内。
2.
加适量胰酶,将离心管置于培养箱中10-20分钟
3.
取出离心管,反复吹打,加足量培养液终止消化。
4.
离心1000转,5分钟。
5.
弃掉上清,加适量培养液,反复吹打20次。
6.
分装到T75中,一般每2个胚胎可以制成一个T75的原代细胞。
7.
置37℃、5%CO
2
、饱和湿度培养箱培养。
8.
待细胞长3-7天细胞互相重叠爬满整个培养瓶底时即可1:3-1:6传代。
9.
吸弃培养液上清。
10.
PBS(不含钙镁)冲洗两次。
11.
加0.25%胰酶-0.02EDT消化。
12.
在显微镜下观察,当少量细胞漂浮,贴壁的细胞层出现裂隙时,用移液管吹打冲洗瓶底5-6次。
13.
即刻加MEF培养液终止消化。
14.
1000转,5分钟离心。吸弃上清。
15.
加足培养液,吹打制成单细胞悬液,分装到各T75中。完成传代。
16.
原代细胞中还有少量组织块未被充分消化,在以后的每次传代过程中要尽量制成单细胞悬液,组织块会逐渐消失。
17.
原代细胞中混有一些杂细胞,一般传到第3代时,杂细胞逐渐减少。小鼠胚胎成纤维细胞为梭状;但连成片时,细胞互相交联,形态不典型。
三、MEF的冻存
1.
当细胞 90%-100% 融合时,尤其细胞少量堆聚可冷冻。
2.
处理方法同二的9-14,每75 cm
2
的细胞 加3 ml 冻存液重悬细胞。
3.
每个冻存管编号加1 ml细胞悬液。
4.
置入程序降温盒-80℃过夜,放入液氮长期保存。
四、灭活MEF制备饲养层细胞
1. 取新的培养瓶,加0.1% Gelatin溶液覆盖预处理30分钟,用前吸掉Gelatin溶液。
2.
取需要处理的MEF细胞,以10ug/ml浓度加丝裂霉素(Mitomycin C)混匀。
3.
置培养箱中3小时。
4.
吸弃废液。
5.
用DPBS洗5遍。
6.
处理方法同二11-14。
7.
处理过的MEF加适量培养液重悬计数,以3.0×10
4
/ cm
2
(MEF)铺在Gelatin处理过的培养瓶上。
8.
置培养箱中静置过夜,使其贴壁。
9.
铺好的饲养层在1-7天内有效,都可以支持mES生长并维持其全能性