贴块法适用于内皮细胞产量低的、管径较小血管的内皮细胞培养,其方法较酶消化法简便、经济。但缺点使易混有成纤维细胞和平滑肌细胞,前者的贴壁时间和内皮接近,后者贴壁较内皮慢,而且会被肝素所抑制。
2. 使用含肝素的培养液(在培养液中加入100 U/ml 的肝素),可使内皮细胞纯度提高;
3. 高浓度的血清和50 µg/ml ECGF 可以充分地促进内皮细胞增殖,而使内皮细胞成为优势细胞。另外,动脉植块干贴壁的时间不宜超过2 h,而加培养液这一步骤尤为关键,过少会使内膜接触不到培养液,过多则易使动脉小块漂浮,导致贴壁失败。因此,干贴壁后加培养液,加入少量高营养的培养液(0.5-1 ml),可以避免这些问题。
一、实验讨论
植块培养法适用于内皮细胞产量低的、管径较小血管的内皮细胞培养,其方法较酶消化法简便、经济。但缺点使易混有成纤维细胞和平滑肌细胞,前者的贴壁时间和内皮接近,后者贴壁较内皮慢,而且会被肝素所抑制。
而由于成纤维细胞生长较快,随着传代次数越多,其污染的程度越重,从而使培养失败。因而,抑制和减少成纤维细胞是大鼠主动脉内皮细胞培养的关键问题。本法采用的方法是:
1. 在合适的时间去除动脉块,即当内皮细胞已经爬出,初具规模时(大概在72 h 左右的时候,按照本文的培养液条件,因为有生长因子,内皮容易爬出和增殖),去除动脉块,并刮除成纤维细胞。
2. 使用含肝素的培养液(在培养液中加入100 U/ml 的肝素),可使内皮细胞纯度提高;
3. 高浓度的血清和50 µg/ml ECGF 可以充分地促进内皮细胞增殖,而使内皮细胞成为优势细胞。另外,动脉植块干贴壁的时间不宜超过2 h,而加培养液这一步骤尤为关键,过少会使内膜接触不到培养液,过多则易使动脉小块漂浮,导致贴壁失败。因此,干贴壁后加培养液,加入少量高营养的培养液(0.5-1 ml),可以避免这些问题。
组织块贴块的时候,不可避免会有一些块贴的方向不是内膜面,那么最后将爬不出内皮,甚至长出较多杂质细胞,需刮除。
另外,部分块即使大小合适,方向也正确,也可能爬不出来,去除组织块的时候,应该以大局为重,看到内皮细胞已经爬出较多,而杂质细胞也开始爬出的时候,就要果断地去除组织块了。72 h 只是个大概的时间,初学者不可以拘泥。
一、实验方法
1. 颈椎脱臼处死大鼠,将整个大鼠浸泡于75%乙醇中消毒约1 min。在无菌状态下,逐层剪开胸腔,分离取出主动脉,放含无菌 D-Hanks’液培养皿中。
1. 颈椎脱臼处死大鼠,将整个大鼠浸泡于75%乙醇中消毒约1 min。在无菌状态下,逐层剪开胸腔,分离取出主动脉,放含无菌 D-Hanks’液培养皿中。
2. 用眼科剪、镊尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织。然后,用含抗生素的D-Hanks’液冲洗血管的外表面及血管腔内的凝血数次,再放入另一无菌培养皿中。
3. 用眼科剪纵向剪开血管,平展在培养皿中。用非常锐利的手术刀将其切成1 mm 3 大小的动脉植 块(或者用剪刀剪,依照个人习惯),然后种植到培养瓶或培养皿(培养瓶或皿用1%明胶预置 37℃下过夜, 使用前2 h 移入CO 2 培养箱中。用时可以先经含 10%小牛血清的培养液冲洗)。将动脉植块的内膜面与瓶底接触,种植密度约为 1 块/cm 2 。
4. 置培养箱中静置2 h(干贴壁)。然后,加入0.5 ml 含 25%胎牛血清的培养液,液量以略盖过动脉植块内膜面,而又不使植块漂浮为宜。24 h 后,更换培养液,加入 2-3 ml 培养液。
5. 72 h 左右的时候,当观察到内皮细胞充分长出,而成纤维细胞刚要长出的时候,将动脉植块除去,刮除成纤维细胞,换培养液1 次。以后每2 天换液一次,每次换1/2~1/3 的液量。继续培养 8-10 d, 细胞融合成单层,即可传代。
二、实验结果
植块培养法进行的原代培养,一般在培养2-3 天,动脉植块周围即有细胞生长,并渐向外延伸,呈扁平短梭形或多角形;约8-10 d 后细胞融合成片。采用vWF 免疫组化鉴定,主要表达在细胞浆中。