将小鼠的肝细胞从机体中取出,经胰酶、螯合剂(常用EDTA)处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备
1. 动物:小鼠。
2. 试剂:DMEM(含血清)、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS。
3. 器械:饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50 ml)、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器。
4. 准备:酒精擦拭台面后把物品摆放好,开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
二、方法
1. 将小鼠断颈致死,置75%酒精泡2-3秒钟,取肝脏,置于盛有PBS的平皿中。
2. 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。
2.3 用手术剪将脏器剪成小块(大小约1mm
2
),玻片研磨,转到离心管,离心(1 000 rpm,5 min)。
4. 视组织或细胞量加入5-6倍(3-5 ml)胰酶,37℃中消化20分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。
5. 加入3-5 ml含血清的培养液以中止胰酶消化作用。
6. 用100目孔径滤网滤过,除去未消化的大组织块。
7. 再次离心5 min,弃上清液。
8. 加入无血清培养液5 ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。
9. 加入含血清的培养液1-2 ml(视细胞量),血球计数板计数。
10. 将细胞调整到5×10
5
/ml左右,转移至6孔培养板中,37℃下培养。