水合氯醛腹腔麻醉,采用胶原酶ⅴ逆行灌注、原位消化及Ficoll-400梯度离心的方法分离、纯化大鼠胰岛,并分离、培养胰岛单细胞。
一、实验步骤
1. 一周龄Wistar大鼠,断颈处死,于75%乙醇浸泡15 分钟,无菌取出胰腺,于冰冷无菌D-Hanks’液中漂洗,用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织,转入青霉素小瓶中。
2. 加入少量无菌D-Hanks’液,用眼科剪剪成0.1-1.0 mm
3
大小的碎片,用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴,再用无菌D-Hanks’液反复清洗 8~10 次,加入10 倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液:0.05 g 胰蛋白酶,0.025 g Ⅴ型胶原酶(663 U/mg),0.05 g 葡萄糖,溶于100mL 无Ca
2+
、Mg
2+
的0.01 mol/L PBS(pH 值为 7.4)溶液,用0.22 µm 微孔滤膜滤菌],38℃±1℃消化,消化过程中不断震荡,10 分钟后弃去上清液。
3. 用无菌D-Hanks’液将组织块清洗 2~3 次,加入新鲜酶液继续消化,重复上述步骤,此时组织块边缘模糊。
4. 将组织块浸入消化酶液中,38℃±1℃消化10 分钟,将消化酶液与组织块分开,组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化;而原消化酶液1500 rpm离心 10 分钟,取沉淀即为消化下的细胞,重新用无菌D-Hanks’悬浮,离心,重复 1~2 次,再用培养基洗 2~3 次,用培养基悬浮即得细胞悬液。
5. 将消化过的组织块重复消化5~6 次至组织块消化完全,重复以上操作。
6. 合并几次所得细胞悬液,计数,调整细胞浓度为 2×10
5
个细胞/mL,将细胞悬液接种于24 孔塑料培养板中,每孔1 mL,置于37℃,5%CO
2
,饱和湿度培养箱中培养。
7. 由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速,接种15 h 后,轻轻振荡培养板,将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中,可除去部分成纤维细胞。
8. 将新培养板中细胞培养 48 小时后,换新鲜配置的含有2.5 ng/mL 的碘乙酸的培养基培养5 h,可除去绝大部分成纤维细胞,而胰岛细胞不受伤害,换不含碘乙酸的培养基洗2 次,并换不含碘乙酸的培养基在 37℃、5% CO
2
,饱和湿度培养箱中培养,每隔 3 天换培养液,获得单层胰岛细胞。