培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代;部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代;悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打传代。
1. 贴壁细胞的消化法传代:
(1)吸除或倒掉瓶内旧培养液。
(2)D-Hanks液洗2~3次。
(3)向瓶内加入适量消化液(胰蛋白酶或与EDTA混合液)轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有细胞表面。
(4)然后吸掉或倒掉消化液后再加适量新的消化液,轻轻摇动再倒掉大部分消化液,仅留少许进行消化(也可不采用上述步骤直接加消化液进行消化)。
(4)然后吸掉或倒掉消化液后再加适量新的消化液,轻轻摇动再倒掉大部分消化液,仅留少许进行消化(也可不采用上述步骤直接加消化液进行消化)。
(5)消化最好在37℃或室温25℃以上环境下进行。
(6)消化2~5 min 后把培养瓶放置显微镜下进行观察,发现胞质回缩,细胞间隙增大后,应立即终止消化。
(6)消化2~5 min 后把培养瓶放置显微镜下进行观察,发现胞质回缩,细胞间隙增大后,应立即终止消化。
(7)吸除或倒掉消化液,如用EDTA消化,需加Hanks液数毫升,轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉。
(8)再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液,终止消化。
(8)再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液,终止消化。
(9)用弯头吸管,吸取瓶内培养液,反复吹打瓶壁细胞,吹打过程要顺序进行。
(10)从培养瓶底部一边开始到另一边结束,以确保所有底部都被吹到,使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。
(10)从培养瓶底部一边开始到另一边结束,以确保所有底部都被吹到,使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。
(11)
计数,分别接种在新的培养瓶内。
2. 悬浮细胞的传代:悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代,或直接传代。
离心传代法:
(1) 将细胞连同培养液一并转移到15 ml 离心管内。
(2)
离心800~1000 rpm,5 min。
(3)
弃去上清,加新的培养液到离心管内,用吸管吹打形成细胞悬液。
(4)
计数,分别接种在新的培养瓶内。
(5)直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后,将上清液吸掉1/2~2/3,然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。
3. 部分贴壁细胞的传代
(1)部分贴壁不牢的细胞,如Hela细胞等,不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来,而进行传代。
(2)对绝大部分贴壁生长的细胞,因直接吹打对细胞损伤较大,细胞常有较大数量的丢失,因而需消化后,才能吹打传代。
注意事项
1. 胰蛋白酶要预温,温度37℃左右为宜℃。
2. 离心转速要合适,转速过低,不能有效分离细胞,离心速度过大,时间过长,会挤压细胞造成损伤甚至死亡。
3. 要定时观察细胞,发现污染,应及时处理。