活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物,用酶联免疫检测仪在490 nm 波长处测定其光吸收值,可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
一、接种细胞
1. 用0.08%胰蛋白酶消化单层培养细胞。
2. 用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液。
3. 以每孔10 3 ~10 4 个细胞接种于96孔培养板中,每孔体积200 ul。
二、培养细胞
1. 将培养板移入CO 2 孵箱中。
2. 在37℃、5% CO 2 及饱和湿度条件下培养。(培养时间取决于实验目的和要求)
三、呈色
1. 每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 ul,37℃孵箱中继续孵育4 h。
2. 终止培养,小心吸弃孔内培养上清液。
3. 对于悬浮生长的细胞,需离心(1000 rpm,5 min),然后弃去孔内培养液。
4. 每孔加入150 ul DMSO,振荡10 min,使结晶物充分溶解。
四、比色
1. 选择490 nm 波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值,记录结果。
2. 以时间为横轴,光吸收值为终轴绘制细胞生长曲线。
注意事项
1. 选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前,对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。
2. 避免血清干扰,一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。
3. 设空白对照,与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时,以空白孔调零。