利用一系列不同浓度的DNA标准溶液(0、2.5、5、10、20、30、40、50 ng/ml),或已知浓度的DNAmarker,和未知浓度DNA样品一起进行琼脂糖凝胶电泳,以EB染色后,在凝胶图象分析仪上观察,比较标准浓度及未知浓度的亮度,来求取DNA的含量;比较DNA样品与DNA marker条带位置,推知DNA 样品分子量。
1. 称取1.5 g 琼脂糖加入盛有100 ml 0.5×TBE电泳缓冲液三角瓶中,摇匀,在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解。加入溴化乙锭(EB)至终浓度0.5 ug/ml,并摇匀。
2. 用胶带将制胶板两端封好,插入适当梳子,将溶解的琼脂糖倒入,室温冷却凝固。
3. 充分凝固后撕掉两端的胶布,垂直向上小心拔出梳子,以保证点样孔完好。凝胶置入电泳槽中,加0.5×TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1~2 mm。
4. 用移液器吸取DNA样品8 μl 与 2 μl 的载样缓冲液混匀,小心加入点样孔,蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点10 μl DNA Marker作为分子量标准。
5. 打开电源开关,调节电压至3-5 V/cm,可见到条带由负极向正极移动,约半小时后即可观察。
6. 在凝胶图象分析仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小;同时比较标准浓度及未知浓度的亮度,求取DNA 的含量。
注意事项
1. A260/A280>1.8表示DNA/RNA的纯度高。若数值<<1.8,表示纯度低,这时由OD260测得的DNA含量较不可信,核酸溶液中含有较多蛋白质,因此最好将前述所得核酸再重新抽取。
2. 测定260 nm 吸光值,OD=1.0代表值如下:
(1)ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml
(2)ss DNA (single stranded DNA or simgle-stranded RNA) = 40 mg/ml
(3)oligonucleotide = 33 mg/ml
3. EB是致癌物质,切勿用手接触,更不要污染环境。