脱落细胞法是指采集人体各部位,特别是管腔器官表面的脱落细胞进行培养。
一、组织培养肿瘤细胞生物学特性
肿瘤细胞与体内正常细胞相比,不论在体内或在体外,在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞,其差异较小,但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点:
1. 形态和性状
培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态,大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰,核膜、核仁轮廓明显,核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密,微丝走行不如正常细胞规则,可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。
2. 生长增殖
肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性,在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖,是因血清中含有很细胞增殖生长的因子,而癌细胞在低血清中(2%~5%)仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后,出现能在低血清培养基中生长的现象,已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时,形成集落(克隆)的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时,接触抑制消除,细胞能相互重叠向三维空间发展,形成堆积物。
3. 永生性
永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡(Apoptosis)。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状,体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽,从而难以证明这一性状的存在。体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此?也尚难肯定。从近年建立细胞系或株的过程说明,如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的,肿瘤细胞应易于培养。事实上,多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛;经过纯化成单一化瘤细胞后,也大多增殖若干代后,便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性,顺利传代生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系,如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等细胞证明,永生性和恶性(包括浸润性)是两种性状,受不同基因调控,但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。
4. 浸润性
浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为,培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时,能浸润入其它组织细胞中,并有穿透人工隔膜生长的能力。
5. 异质性分学
所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织;处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多,增殖旺盛,中心区有的细胞衰老退化,有的处于周期阻滞状态,那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞(Stem Cells)、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖;把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。
二、体外培养肿瘤细胞生物学检测
二、体外培养肿瘤细胞生物学检测
一旦培养的肿瘤细胞生长成形态上单一的细胞群体或细胞系(或株)后,不论用于实验研究还是建立细胞系,都需要做一系列的细胞生物学测定,主要的目的在于求得证明:所培养的细胞系的确来源于原体内具有恶性的细胞,而非正常细胞或其它细胞。均具有瘤种特异性。阐明一般生物学性状。
测定项目数量无明确规定,根据需要而定,以下为常做的项目和要点。
1. 形态观察
主要观察细胞的一般形态,如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。
主要观察细胞的一般形态,如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。
2. 细胞生长增殖
检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。
检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。
3. 细胞核型分析
检测核型特点,染色体数量、标记染色体的有无、带型等。
检测核型特点,染色体数量、标记染色体的有无、带型等。
4. 凝集试验
检测凝集力。
检测凝集力。
5. 软琼脂培养
检测集落形成能力。
检测集落形成能力。
6. 异体动物接种
向异体动物体内(皮下)接种细胞悬液,观察成瘤能力。
向异体动物体内(皮下)接种细胞悬液,观察成瘤能力。
7. 其它
除上述项目外,根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析,荧光显微镜观察等。
除上述项目外,根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析,荧光显微镜观察等。
在上述肿瘤细胞生物学检测中,最主要的为:异体动物(以用裸鼠为上)接种成瘤、软琼脂培养、核型分析、细胞骨架和电镜观察等几项。当然从分子细胞学角度考虑尚应做癌基因和抗癌基因等的检测。
一、将新鲜的肿瘤组织去除脂肪和结缔组织。
二、洗液洗2次后,用刀片将肿瘤组织切成细薄片。
三、在切割的同时有许多上皮细胞脱落下来,脱落细胞经洗涤后,加入完全培养基,便可获得较纯的上层细胞。
四、于培养瓶(或皿)中,37℃、5%CO 2 下培养,每隔2-3天换液一次,7-10天上皮细胞逐渐长成单层。
二、洗液洗2次后,用刀片将肿瘤组织切成细薄片。
三、在切割的同时有许多上皮细胞脱落下来,脱落细胞经洗涤后,加入完全培养基,便可获得较纯的上层细胞。
四、于培养瓶(或皿)中,37℃、5%CO 2 下培养,每隔2-3天换液一次,7-10天上皮细胞逐渐长成单层。