将自皮质切除的组织快切成碎块，冲洗后放入胶原蛋白酶和胰蛋白酶混合液，摇晃消化。定时用吸管研磨组织块，然后手机分离的细胞。用一定孔径大小的滤网过滤细胞悬液，除去未消化的组织块。然后，洗细胞，清除消化酶。用添加血清的培养液混悬细胞，将细胞接种于塑料培养器皿。

一、材料

无菌

1. 基础培养液：DMEM 和 F12 混合液 50：50

2. FBS（Sterile Systems, Hyclone)

3. 完全培养液：DMEM 和 F12 混合液，添加 10%FBS

4. BSS

5. 0.1% 胶原蛋白酶（IV 型，Worthington）和 0.1% 胰蛋白酶（1：250，Sigma）混合液，用 0.15mol/L NaCl 配制

6. 0.5 mg/ml DNase，用生理盐水配制

7. 胰蛋白酶和 EDTA 混合液：用 0.1% 胰蛋白酶（1：250）和 1 mm/L EDTA(培养基，Sigma）配制

8. 手术刀和组织镊

9. 孔径为 160um 的 Nitex 滤网（Tetko）

10. 培养皿和培养瓶

11. 50 ml 试管

非灭菌

1. 有轨振荡器（Bellco）

二、操作步骤

消化组织

1. 按冠状面将肾切成 5~10 mm 厚的组织片。用冰冷的基础培养液洗组织片。

2. 从皮质的外层切下组织，然后用十字刀片切成 1~2 mm 小块。

3. 将约 5 ml 组织块放入盛有预热的 20 ml 胶原蛋白酶和胰蛋白酶混合液的 50 ml 试管。

4. 轻轻摇晃，孵育组织块 1 h。

5. 吸除消化液，然后加入新鲜消化液。

6. 每隔 20 min 收集细胞悬液，然后加入 20 ml 含有 0.5 mg/ml DNase 的培养基础液，用 10 ml 吸管轻轻研磨 10 转。

7. 用等量的完全培养液稀释收集的细胞悬液。将稀释后的细胞悬液置于冰上。

8. 重复收集步骤 5 次或 5 次以上，直至组织块被完全分散。

9. 将收集的细胞悬液混合，分装如 50 ml 试管，

10. 离心（100 g，15 min）后，用 45 ml 含 DNase 的完全培养液混悬细胞。

11. 用孔径为 160um 的 Nitex 滤网过滤细胞悬液。

12. 这种分离方法既分离到系抱团，又分离到单个细胞，故细胞计数不可靠。每个 75 cm2 培养瓶内放 15 ml 细胞悬液，细胞扩增后传代培养或冻存。