取小鼠腹腔巨噬细胞与乳胶颗粒在不同培养条件下混合后定量加入24孔板,37 ℃,5% CO2 培养箱中孵育后,荧光显微镜下计数吞噬百分率和吞噬指数。 一、讨论
巨噬细胞一般没有特殊的鉴定方法,有两条经验:
1. 巨噬细胞是终末分化细胞,不会增殖
2. 很难消化下来,所以接种的时候,必须直接接种到目的培养器皿中。
一、实验步骤
1. 如果采用刺激物,则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL,获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物,直接开始下面的步骤。
2. 拉颈处死小鼠,在75%酒精浸泡1-2 分钟,移入超净台中,仰卧位固定于解剖板上,碘酒消毒腹部皮肤,酒精绵球脱碘。用手术直剪充分剪开腹部皮肤,暴露腹部肌层,再用酒精绵球消毒腹部肌层。
3. 用注射器抽取5mL 含双抗的RPMI 1640 培养基注入腹腔,用绵球轻揉腹部1-2 min,然后,用眼科镊稍提起腹腔,并用眼科剪剪开一个小口,用吸管吸取细胞悬液,移入离心管中(个人认为,此法比用注射器抽吸好一些)。
4. 1000 rpm 离心5 min 后,用含双抗的RPMI 1640 培养基洗涤一次,再次离心,重悬细胞于含10% 小牛血清的RPMI 1640 培养液中,如果是作为饲养细胞使用,则选择相应的培养液。台盼蓝拒染法计数,将细胞稀释到目的浓度后,接种即可。
5. 如果是作为饲养细胞使用,调整浓度至2x10
5
个/mL,接种到96 孔板中,每孔100-200 µL;如 果作为其它实验使用,可以调整成2x10
6
/mL,加到 24 孔平底培养板中,1 mL/孔;5% CO
2
温箱孵育2 h 后, 换液,并用RPMI 1640 培养基洗1-2 次,弃去未粘附细胞,贴壁细胞为单层的巨噬细胞。
二、结果
二、结果
巨噬细胞刚贴壁时偏圆形,或者类似鹅卵石形状,然后慢慢伸出伪足,铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性,当与细菌混合在一起的时候,在40 倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌,因此,巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。
注意事项
注意事项:严格无菌操作,在超净台内进行;为避免交叉感染,每一只小鼠更换注射器;吸管吸取细胞悬液的时候,尽量不要吸到大小肠,否则容易引起成纤维细胞污染。