活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞 表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性 百分率即可知相应抗原的密度和分布。 一、附录
1. DPBS （×10， 贮存液）
NaCl 80 g，
KCl 2 g，蒸馏水加至1000 ml，
Na
2
HPO
4
11.5 g，临用时用蒸馏水1∶10稀释，
KH
2
PO
4
2 g
2. 洗涤液
DPBS 900 ml，
FCS 50 ml（终浓度5 ％），
4 ％ NaN
3
50 ml（终浓度0.2 ％）
3. 固定液
DPBS 1000 ml，
葡萄糖 20 g（终浓度2 ％），
甲醛 10 ml，
NaN
3
0.2 g （终浓度0.02 ％）
1. 制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、
胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）
3. 取40 μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50 μl） 的小玻璃管或塑料离心管，再加50 μl 1∶20（用DPBS 稀释）灭活正常兔血清， 4 ℃ 30 min
4. 用洗涤液洗涤2 次，每次加洗涤液2 ml左右， 1000 rpm×5 min
5. 弃上清，加入50 μl工作浓度的羊抗鼠（ 或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇， 4 ℃ 30 min
6. 用洗涤液洗涤2 次，每次加液2 ml左右， 1000 rpm×5 min
2. 用10 ％FCS RPMI1640调整细胞浓度为
5×10
6
～1×10
7
/ml
3. 取40 μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50 μl） 的小玻璃管或塑料离心管，再加50 μl 1∶20（用DPBS 稀释）灭活正常兔血清， 4 ℃ 30 min
4. 用洗涤液洗涤2 次，每次加洗涤液2 ml左右， 1000 rpm×5 min
5. 弃上清，加入50 μl工作浓度的羊抗鼠（ 或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇， 4 ℃ 30 min
6. 用洗涤液洗涤2 次，每次加液2 ml左右， 1000 rpm×5 min
7. 加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入
1 ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，
视细胞浓度加入100～500 μl固定液）
8. FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（
标本在试管中可保存5～7 天）
注意事项
1. 整个操作在4 ℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN
3
，上
述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴 性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非 特异性染色。
4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴 性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非 特异性染色。
4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。