材料
无菌
处于合适时期的细胞(若使用热的 2mol/L PCA 方法需要细胞生长于玻璃器皿或试管中,若用其他方法,细胞可培养于常规的塑料皿中)
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H-TdR ,0.4 MBq /ml (约 10uC i/ml),每毫升培养液用 lOOul
提示
某些培养基,例如 Ham’s FlO 和 F12 , 含有胸腺嘧啶脱氧核苷。它将最终决定加入的
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H -TdR 的特异活性。因此当判断加入同位素的量时,必须要考虑到此种因素。当同位素为 40KBq/ml (约 1.0Ci/m l) 时则对于大多数培养基已足够时,对于 F10 或 F12 应当用 0.2MBq/ml(约 5uCi/ml)。
非无菌
三氯醋酸(TCA ),0.6mol/L (置冰上),每毫升培养液 6 ml
HBSS 或 D- PBSA ,冰上,每毫升培养液 2 ml
高氣酸,2mol/L 或 0.3m o l/L NaCl 含 35 mmol/L 十二烧基硫酸钠(SLS ,SDS),每毫升培养基 0.5 ml
MeOH ,每毫升培养基 lml
液闪瓶
闪烁液(10X 高氯酸或 NaOH/SDS)
操作步骤
1. 细胞培养至所需密度(通常最高的 DNA 合成处于中对数期或者用密度限制性 DNA 合成的平台期,(见 18.5.2 节)。
2. 加人
3
H -TdR ,溶于 HBSS 的 40KBq/ml (约 1.0Ci/ml) 或 2MBq /mmol (约 50Ci/mol)。
3. 按实验需要温育细胞 1~24 h。
4. 小心地吸去放射活性培养液,置于液态放射活性废弃物的适当容器中。
5. 用 2 ml HBSS 或 PBSA 小心地洗细胞,加人 0.6mol/L 2 ml 冰上预冷的 TCA ,静置 lOmin。如果细胞松散地黏附,则用 MeOH 固定细胞(见方案 21.6)。
6. 用三氯醋酸洗细胞 2 次,每次 5 min 。
7 . 加人 0.5m1 2mol/L 高氯酸,置 60°C 热板上 30 min,然后让其冷却。或者加 0.5 ml 溶于 NaOH 中的 SLS ,然后在 37°C 温育 30 min ,或者在室温中过夜。
8 . 收集可溶性沉淀物,将其转移至闪烁液中,在闪烁仪中测定放射活性。
用3H -TdR 标记细胞,提取DNA用闪烁仪测定放射活性水平
2014-12-12