材料
无菌
单层细胞培养,A549,Vem 或 HeLa-S3, 75 cm 2 培养瓶,晚对数期 1 瓶
0.25% 粗制胰蛋白酶,混合有 lOmmol/L EDTA 5 ml
生长液,含 2 mmol/LNaHC0 3 200 ml
D-PBSA(用于清洗和细胞计数)50 ml
25 cm 2 培养瓶 24 个
操作步骤
1. 对于一般的传代,先用胰蛋白酶消化细胞(见方案 13.2)。
2 . 稀释细胞悬液分别至 2X10 4 个细胞/ml,150 ml 培养基。
3 . 接种于 24 个 25 cm 2 培养瓶。
4. 封好培养瓶,然后置于 37°C 温箱内。
提示 用低碳酸盐(4 mmol/L) 培养基对本方案有方便之处,如果碳酸盐浓度过高(如 23 mmol/L ), 则通入 5% C02 或置于 C02 孵箱中,用透气性盖子。
5. 24 h 后,从温箱中取出第一次的 2 瓶细胞,计数细胞数:
(a) 将每瓶培养液完全吸掉;
(b) 每瓶加入 2 ml 胰蛋白酶/EDTA;
(c) 温育培养瓶 15 min;
(d ) 用胰蛋白酶/EDTA 将细胞分离下来,取 0.4 ml 细胞悬液至 19.6 ml 的 D-PBSA 中以备计数;
(e) 用电子细胞计数仪计数细胞。
6 . 如第 5 步,在 4、8 和 72 h 时重复取样。
7 . 于 72 h 时或者更早一些时间换培养液,这可依据 PH 的下降来决定(见方案 13.1 ; 彩图 22b )。
8. 对于迅速生长的细胞(即 PDT 为 12~24 h 的细胞)可以每天连续取样,但是对于生长缓慢的细胞(也就是 PDT > 24 h ),则每两天取样,直至细胞达到平台期。
9 . 依据 pH 的改变,每 1、2 或 3 天换培养基。
10.于 2 、5、7、10 天取一个培养瓶染细胞(见 16.4.2 节)。
提示 也可以用血球计数板进行细胞计数,但这对于细胞浓度较低者尤其在生长曲线的开端比较困难。如果要用血球计数板,可将胰蛋白酶的容积减少至 0.5 ml,小心地用微吸管将细胞分散,使之不产生气泡, 然后将细胞移至血球计数板。