材料
无菌
培养细胞
生长液
0.25% 粗制胰蛋白酶
D-PBSA
3
H-胸腺嘧啶脱氧核苷,2.0MBq/ml (约 50uCi/ml),75 GBq/mmol (约 2Ci/mmol)
安全提示 处理
3
H-胸腺嘧啶脱氧核苷时要谨慎, 因为它是放射活性物质和基因产物!要遵照当地指南操作(见 7.7 节)。
多孔培养板,内含 13 mmThermanox 盖片(Nalge Nunc)
非无菌
血球计数板或电子计数器
D-PBSA
醋酸甲醇(1 份冰醋酸加入 3 份甲醇),冰冷,新鲜配制
显微镜载片
封胶(如 DPX 或 Permount)
三氯乙酸(TCA ),0.6mol/L ,冰冷
去离子水
甲醇
操作步骤
1. 在装有盖片的 24 孔培养板中,以 2X10
4
~5X10
4
个/ml 培养细胞。
2. 待细胞贴壁,开始增殖(48~72 h) , 让其达到所需要的细胞密度。
3. 在培养液中加入
3
H -胸腺嘧啶脱氧核苷,100KBq/ml(约 5uCi/ml),将细胞继续培养 30 min 。
提示
某些培养基,例如 Ham’s F10 和 F12,它们含有胸腺嘧啶脱氧核苷 (表 9.3,10.1 和 10.2),那么放射活性的胸腺嘧啶脱氧核苷的浓度要增加,这样方能在培养液内达到相同的特异活性。
4. 除去标记液体,将它弃于专用的放射废物容器中。
5. 用 D-PBSA 清洗盖片 3 次。每冲洗一次,要从孔底部揭起盖片(但不要超出该孔),以便使盖片底部的同位素能冲掉。
6. 加人 1:1 的 D-PBSA : 醋酸甲醇,每孔 lml,然后立即吸去。
7. 每孔加人 lml 冰醋酸(4℃ ),静止 l0 min。
8. 取出盖片,用风扇吹干。
9. 将盖片封固于显微镜载片上,细胞面朝上。
10. 让封固胶过夜干燥。
11. 将载片放在含 0.6mol/L TCA 的染色缸中(4°C),静置 lO min,在此过程中更换 2 次 TCA,借此可除去未掺人的前体物。
12. 用去离子水淋洗,然后改用甲醇,晾干。
13. 准备放射自显术(见方案 27.3. )。
14. 当放射自显影进行一段曝光时间(通常 1~2 个星期),显影,染色(见方案 27.3),40 倍显微镜下观察。
15. 计数标记细胞的百分比。为了涵盖代表区,按图 21.14 所示进行扫描观察。
细胞培养至适当密度,用1H -胸腺嘧啶脱氧核苷标记 30min,清洗后固定细胞,除去未掺入的前体物,准备同位素放射自显术。
2014-12-12